丹皮酚对湿疹模型小鼠SP、NK1R表达及肥大细胞活化的影响

2020-09-22肖卫棉查旭山王友发

天津医药 2020年9期

肖卫棉，查旭山△，王友发

湿疹作为一种常见皮肤炎症反应，可由多种因素引起，典型症状在儿童期开始出现，发病程度轻重不一，容易反复发作且难于根治，严重影响患者生活质量［1-2］。湿疹发病机制不明，但近年来研究发现肥大细胞活化参与湿疹发病过程，并对此的临床研究越来越多［3-4］。P 物质（substance P，SP）/神经激肽 1受体（neurokinin 1 receptor，NK1R）复合物参与湿疹、慢性荨麻疹及慢性结肠炎等疾病过程［5-6］，同时也参与调控肥大细胞脱颗粒过程［7］。因此，探究湿疹过程中SP、NK1R 表达及其对肥大细胞活化的影响具有重要临床意义。丹皮酚是从牡丹皮、芍药、徐长卿等草本植物中提取的一种生物活性物质［8］。近年来研究发现，丹皮酚可祛风、除湿、止痒、凉血活血，同时可缓解患者皮肤瘙痒、红疹及皮肤渗出液中炎性浸润和细菌感染等症状，其抗炎、抗过敏作用在治疗湿疹方面具有较好的疗效［9-10］，但其作用机制尚不清楚。本研究通过建立湿疹小鼠模型，分析丹皮酚对其皮损组织SP/NK1R 表达及肥大细胞活化的影响，以期为湿疹的临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康清洁级C57BL 小鼠120 只，体质量100～120 g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号SCXK（粤）2018-0002，动物质量合格证号为省科委2000A027。所有小鼠于本院动物房中饲养。饲养条件：自然光照，温度25 ℃，相对湿度50%，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。小鼠自由进食、饮水。本研究经动物伦理委员会批准同意，批号为IACUC-01（20160917），实验符合3R原则。

1.1.2 主要试剂及仪器丹皮酚（EB03479，25 g/瓶）购自上海士锋生物科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（P0768）购自美国Pierce 公司；小鼠SP 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（YS-E1627）购自上海研生生化试剂有限公司；2,4-二硝基氯苯（DNCB，138630-100G）购自美国Sigma-Aldrich 公司；地塞米松（B25793-100 mg）购自上海源叶生物科技有限公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（ZN1970-IQN）购自北京百奥莱博科技有限公司；类胰蛋白酶（Tryptase）抗体（orb241128）购自英国Biorbyt公司；NK1R抗体（ATA33963）购自武汉益普生物科技有限公司。蛋白电泳仪（型号1659001）、半干转膜仪（Trans-Blot SD）购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠湿疹模型建立及分组给药参照文献［11-13］构建小鼠湿疹模型，具体操作方法为：取100 只小鼠，用5%DNCB 溶液40 μL涂于小鼠双耳内侧致敏后，以1%DNCB 溶液40 μL涂于小鼠双耳内侧，每隔4 d致敏1次，共5次后，肉眼观察小鼠双耳内侧皮肤性状，若出现红肿增厚或渗出现象表明模型建立成功。将模型建立成功的小鼠用随机数字表法分为湿疹模型组，丹皮酚低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）剂量组［11］，另设阳性药物（地塞米松0.65 mg/kg）组，每组20 只。另取20 只小鼠，于小鼠双耳内侧涂抹5%氯化纳溶液每次40 μL，后期用1%氯化纳溶液40 μL 涂抹，每隔4 d 涂抹1 次，共5 次，作为空白对照（Control）组。丹皮酚低、中、高剂量组及阳性药物组均经腹腔注射给予相应剂量药物0.5 mL，1次/d，共14 d；Control组和湿疹模型组经腹腔注射等量生理盐水。

1.2.2 小鼠耳部湿疹皮损程度评分各组小鼠末次给药1 h后，参照文献［12］进行皮损程度计分：5～6分，双耳明显红肿增厚、角化结痂或渗出；3～4分，红肿较轻、中度角化者或渗出不明显；1～2 分，红肿和渗出均不明显，或者轻度角化；0 分，正常皮肤。每组小鼠评分取平均值。

1.2.3 小鼠皮损组织HE染色病理学检测各组小鼠在做完评分后处死，取双侧耳部组织，剪取0.5 g 置于-80 ℃冰箱中保存，其余组织置于4%多聚甲醛中固定，做石蜡切片。将切片进行二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后，HE 染色6 min，1%盐酸乙醇分化15 s，蒸馏水漂洗3 min，梯度乙醇脱水3 min，二甲苯透明处理并用中性光学树脂封片，光镜下观察各组耳部病变组织炎症细胞浸润情况。

1.2.4 ELISA法检测SP含量取小鼠耳部组织，于4 ℃冰箱中解冻后制成10%组织匀浆，离心后，按ELISA 试剂盒说明书检测SP含量。

1.2.5 免疫组化法检测耳部组织Tryptase 及NK1R表达取石蜡切片，进行常规脱蜡、脱水，用柠檬酸缓冲液进行抗原修复，3%过氧化氢酶灭活后，加入兔抗鼠一抗抗体（Tryptase、NK1R均为1︰500），于30 ℃孵育过夜，经TBST漂洗3次，加入1︰1 000的羊抗兔二抗溶液，室温孵育1 h，经TBST漂洗后，加SP 复合物和DAB 显色剂，苏木精-伊红溶液复染，并进行透明、封片。然后于400 倍光镜下拍照，每片随机读取5 个视野，采用Image Pro Plus 5.0图像分析系统进行半定量测量，结果以5个视野阳性表达的平均光密度值表示。

1.3 统计学方法以SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较进行单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹皮酚对小鼠耳部湿疹皮损程度及评分的影响 Control组，湿疹模型组，丹皮酚低、中、高剂量组及阳性药物组耳部湿疹皮损评分分别为0分、（5.99±0.10）分、（4.88±0.09）分、（3.02±0.10）分、（2.05±0.09）分、（2.01±0.09）分（n=20，F=7 120.203，P＜0.01）。与Control 组相比，湿疹模型组小鼠耳部皮肤可见红肿、角化结痂、渗出等损伤，皮损程度评分增加（P＜0.05）；与湿疹模型组相比，丹皮酚低、中、高剂量组耳部皮肤红肿、角化结痂、渗出等损伤减轻，皮损程度评分降低（均P＜0.05），且丹皮酚各剂量组呈剂量依赖性；丹皮酚高剂量组与阳性药物组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.2 各组小鼠耳组织病理损伤程度观察 Control组小鼠耳部皮肤组织结构清楚，层次分明，表皮厚度正常；湿疹模型组小鼠表皮角化过度，真皮层可见大量炎症细胞浸润；丹皮酚低、中、高剂量组及阳性药物组小鼠表皮层角化及真皮层炎症细胞浸润明显改善。见图2。

2.3 丹皮酚对小鼠皮损组织中SP 含量的影响与Control组相比，湿疹模型组小鼠耳部皮损组织SP表达水平明显升高（P＜0.05）；与湿疹模型组相比，丹皮酚低、中、高剂量组及阳性药物组小鼠耳部皮损组织SP 含量明显降低（P＜0.05），且丹皮酚各剂量组呈剂量依赖性；丹皮酚高剂量组与阳性药物组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of SP contents and the expressions of NK1R and Tryptase between six groups表1 各组小鼠SP含量及NK1R、Tryptase表达结果比较（n=20，）

＊＊P＜0.01；a与Control组比较，b与湿疹模型组比较，c与丹皮酚低剂量组比较，d与丹皮酚中剂量组比较，P＜0.05

组别Control组湿疹模型组丹皮酚低剂量组丹皮酚中剂量组丹皮酚高剂量组阳性药物组F SP（ng/L）100.39±10.93 251.62±11.12a 201.00±12.13ab 174.82±11.16abc 144.55±10.96abcd 140.55±11.14abcd 442.620＊＊NK1R 0.39±0.13 1.62±0.12a 1.00±0.13ab 0.82±0.12abc 0.55±0.14abcd 0.54±0.14abcd 237.784＊＊Tryptase 0.32±0.14 1.86±0.16a 1.25±0.13ab 0.89±0.14abc 0.66±0.15abcd 0.67±0.15abcd 280.477＊＊

2.4 丹皮酚对小鼠皮损组织中NK1R 及Tryptase 表达的影响与Control 组相比，湿疹模型组小鼠耳部皮损组织NK1R、Tryptase 表达水平明显升高（P＜0.05）；与湿疹模型组相比，丹皮酚低、中、高剂量组及阳性药物组小鼠耳部皮损组织NK1R、Tryptase 表达明显降低（P＜0.05），且丹皮酚各剂量组呈剂量依赖性；丹皮酚高剂量组与阳性药物组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1，图3、4。

3 讨论

3.1 各组小鼠模型建立情况及丹皮酚对湿疹模型小鼠的改善作用湿疹是皮肤科常见炎症性皮肤疾病，其发病率高，容易迁移，肥大细胞及炎症介质变态反应参与湿疹的发病过程［14］。李雪松［15］发现丹皮酚软膏可治疗手部慢性湿疹，且在减轻手部脱屑、皲裂方面的疗效优于派瑞松。杨正生等［11］发现腹腔注射丹皮酚可治疗小鼠变应性接触性皮炎，降低其炎症反应。本研究发现，与Control 组相比，湿疹模型组小鼠肉眼可见耳部充血、肿胀等损伤，皮损程度评分明显增高，HE 染色可见耳部皮损组织表皮角化、真皮水肿、炎症浸润等病理损伤，提示湿疹模型建立成功。与湿疹模型组相比，丹皮酚低、中、高剂量组及阳性药物组小鼠耳部充血、肿胀等损伤减轻，皮损程度评分降低，表皮角化及真皮水肿、炎症浸润等病理损伤程度明显下降，表明丹皮酚可改善湿疹模型小鼠耳部组织红肿、充血及表皮角化、真皮水肿等炎症损伤。

3.2 丹皮酚对湿疹模型小鼠耳部组织SP 及NK1R表达的调控作用 SP 是皮肤肥大细胞重要的促分泌素，其过表达可促进肥大细胞脱颗粒，促进炎症的发生［16］。NK1R 激活可介导 SP 诱导的肥大细胞募集，增强促炎反应［17］。Tryptase是肥大细胞合成和分泌的特异性中性蛋白酶之一，常被用作肥大细胞活性标志物，其阳性表达可促进肥大细胞脱颗粒释放活性物质，增强炎症状态下结缔组织重塑［18-20］。Choi 等［21］发现局部使用 SP 可缓解 DNCB 诱导的小鼠特异性皮炎症状。Zhan 等［5］发现SP 可诱导肥大细胞积聚，湿疹患者中SP表达升高，而使用SP阻滞剂和NK1R阻滞剂可有效治疗湿疹。李磊磊等［22］发现Tryptase 在斑秃患者皮损组织中表达增高，且Tryptase 阳性表达的肥大细胞参与斑秃病理过程。本研究发现，与Control 组相比，湿疹模型组小鼠耳部皮损组织中SP、NK1R、Tryptase 表达升高，提示湿疹模型小鼠SP、NK1R 表达增高，肥大细胞活性较高；而丹皮酚低、中、高剂量组小鼠耳部皮损组织中SP、NK1R、Tryptase 表达降低，且丹皮酚各组呈剂量依赖性，表明丹皮酚可抑制湿疹模型小鼠耳部皮损组织中SP、NK1R 表达，抑制肥大细胞活化，缓解湿疹小鼠皮肤炎性损伤。

综上所述，丹皮酚可能通过抑制皮损组织中SP、NK1R 表达，抑制肥大细胞活化，缓解湿疹小鼠皮肤炎性损伤症状，为临床治疗湿疹提供一定的参考；但本研究也存在一定的不足，本研究未设置SP、NK1R 阻滞剂进行研究，丹皮酚也可能通过其他途径改善湿疹症状，这有待后续继续研究。