TRAP1对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响

李品玉，盛文杰，张嫄怡，杨坚，郑培丽，张菲菲

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤第5位［1］。肿瘤细胞增殖和凋亡抵抗是导致不良预后的原因之一，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（protein-serine-threonine kinase，AKT）信号通路是经典的肿瘤相关信号通路，对CRC细胞增殖和凋亡发挥重要的调节作用［2］。因此，针对PI3K/AKT信号通路关键节点以及调控因子进行研究有望为改善CRC患者预后提供新的突破点。肿瘤坏死因子受体相关蛋白1（tumor necrosis factor receptorassociated protein 1，TRAP1）是近年来研究发现的肿瘤相关蛋白，在多种肿瘤中异常表达［3］，广泛参与调节肿瘤细胞周期、增殖、凋亡、迁移、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等多种生物学行为。目前TRAP1蛋白与CRC关系的研究已初见报道［4-5］，但其相关生物学功能仍不清楚。本研究旨在探讨TRAP1在CRC中的表达和对CRC细胞增殖、凋亡的影响，及其对PI3K/AKT信号通路的调节作用，为针对TRAP1蛋白设计抗癌药物提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 （1）标本：选取2018年在南方医科大学南方医院进行手术治疗的6 例CRC 患者的癌及癌旁配对黏膜组织，所有患者手术前均未接受过放化疗或靶向治疗。所有标本在离体后均经预冷的PBS 洗涤干净，液氮迅速冷冻后置于-80 ℃保存。（2）细胞及主要试剂：人结直肠癌细胞株LOVO、HT29、HCT116、RKO、SW480 及正常结肠永生化上皮细胞NCM460 均由南方医科大学病理实验室提供。胎牛血清和RPMI-1640 购自美国 GIBCO 公司，TRAP1（兔多抗）、GAPDH（鼠单抗）、CyclinD1（兔多抗）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗购于Proteintech公司，Cleaved-casp3（兔多抗）、casp3（兔多抗）购自Affinity公司，p-PI3K（兔单抗）、PI3K（兔单抗）、p-AKT（兔多抗）、AKT（兔多抗）抗体购自Cell Signaling Technology 公司；LipofectamineTM3000 购自 Life Technologies，CCK8 试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，细胞周期及Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 通过Oncomine 数据库分析TRAP1 表达 打开Oncomine 数据库（https://www.oncomine.org/），选择分析类型为Cancervs.Normal Analysis，肿瘤类别（Cancer Type）选择Colorectal Cancer进行分析，设置P＜0.05为有统计学意义。

1.2.2 细胞转染 取对数生长期的SW480细胞，以1×106个/孔接种于6 孔板中，待细胞密度为30%～50%时采用Lipofectamine 3000分别转染对照序列NC和TRAP1的干扰序列，操作严格按照Lipofectamine 3000 转染试剂盒说明书进行。TRAP1 干扰序列购自苏州吉玛公司，si-1 引物：上游5´-CGGUCCCUGUACUCAGAAATT-3´ ，下 游 5´-UUUCUGAGUACAGGGACCGGG-3´；si-2 引物：上游5´-GCUACACCCUGCACUAUAATT-3´，下 游 5´-UUAUAGUGCAGGGUGUAGCGG-3´；si-3 引物：上游 5´-CCTTCCTGGATGCTCTGCATT-3´，下游5´-TGCAGAGCATCCAGGAAGGCC-3´。

1.2.3 Western blot 检测TRAP1 蛋白对细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白及PI3K/AKT通路的影响 提取组织和细胞全蛋白，定量后用10%SDS-PAGE 凝胶对蛋白进行电泳分离，湿法转印至PVDF膜上，将膜放入5%牛奶，配摇床缓慢摇动封闭1 h，加入稀释后的一抗TRAP1（1∶1 000）、CyclinD1（1∶1 000）、Cleaved-Casp3（1∶1 000）、Casp3（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，次日PBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000），配摇床室温孵育1 h，PBST洗膜3次后ECL化学发光显色，并应用Image J 软件分析目标蛋白和内参蛋白灰度值，相对表达量=目标灰度值/内参灰度值。

1.2.4 CCK-8 法检测TRAP1 对CRC 细胞增殖的影响 将TRAP1的干扰片段及对照片段瞬时转染入SW480细胞，24 h后消化并计数，以1 000 个/孔的密度接种于96 孔板，分别于24、48、72、96、120 h将孔内培养基更换为含10%CCK-8试剂的培养基，37 ℃、5%CO2条件下孵育2 h，全自动酶标仪490 nm 处测定光密度（OD）值，并绘制细胞增殖曲线。每组细胞设置5个平行复孔，实验重复3次。

1.2.5 平板克隆实验检测TRAP1对CRC 细胞克隆形成能力的影响 将干扰TRAP1的SW480细胞及对照细胞计数后以200 个/孔种植于 6 孔板中，37 ℃、5%CO2条件下培养 2 周，甲醇固定15 min，PBS 洗 3 次，吉姆萨染色15 min，水洗后拍照计数克隆数目。

1.2.6 流式细胞术检测TRAP1对CRC 细胞周期的影响 将干扰TRAP1 的SW480 细胞及对照细胞消化后离心弃上清，预冷的PBS 洗涤2 次，预冷的75%乙醇固定1 h，离心弃上清加入25 μL PI染色液和10 μL RNase A，4 ℃避光反应30 min，利用流式细胞仪对各组细胞进行检测。

1.2.7 流式细胞术检测TRAP1对CRC 细胞凋亡的影响 将干扰TRAP1 的SW480 细胞及对照细胞用不含EDTA 的胰酶消化后1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤3次。随后用100 μL的 Binding Buffer 重悬细胞，并加入 5 μL AnnexinV-APC 及 5 μL PI 染色液，混匀室温避光反应 15 min，再加入400 μL 的Binding Buffer混匀后上机检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件进行数据处理，所有实验均独立重复3次，计量资料用均数±标准差（）表示，两样本均数比较采用t检验，多组间的均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Dunnett-t检验。CCK8 结果采用析因分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRAP1 在CRC 组织和细胞中的表达 通过Oncomine 数据库分析，在Notterman 数据库中，正常结直肠组织TRAP1 比结直肠癌组织中升高（n=18，Fold=3.408，P＜0.01）。Skrzypczak 数据库中分析发现TRAP1 在结直肠癌组织中的表达比正常肠黏膜组织高（n正常=24，n肿瘤=45，Fold=2.014，P＜0.01）。Western blot 显示，6 对 CRC 组织中 TRAP1 的表达明显高于癌旁配对正常肠黏膜组织，见表1、图1A。在结直肠癌细胞LOVO、HT29、HCT116、RKO、SW480中TRAP1的表达水平（分别为0.81±0.02、1.21±0.04、1.55±0.04、1.89±0.04、2.00±0.03）也明显高于正常永生化结肠上皮细胞NCM460（0.45±0.02），差异有统计学意义（n=3，F=85.297，P＜0.01），见图1B。

Tab.1 Expression levels of TRAP1 in CRC tissues and their paired paracancerous tissues表1 TRAP1在CRC组织及癌旁正常组织中的表达（n=3，）

Tab.1 Expression levels of TRAP1 in CRC tissues and their paired paracancerous tissues表1 TRAP1在CRC组织及癌旁正常组织中的表达（n=3，）

＊＊P＜0.01

组别正常组织肿瘤组织t标本1 0.43±0.01 0.84±0.02 30.662＊＊标本2 0.73±0.02 1.07±0.05 11.480＊＊标本3 0.72±0.02 1.03±0.06 8.809＊＊组别正常组织肿瘤组织t标本4 0.53±0.02 1.18±0.07 16.790＊＊标本5 0.61±0.02 1.56±0.05 29.306＊＊标本6 0.53±0.02 1.15±0.05 19.853＊＊

Fig.1 The expressions of TRAP1 in CRC tissues and cells图1 TRAP1在结直肠癌组织和细胞中的表达

2.2 TRAP1 对CRC 细胞增殖的影响 Western blot结果显示，TRAP1 的干扰序列均有效，NC、si-1、si-2、si-3 组干扰效率分别为 1.40±0.03、0.21±0.02、0.36±0.03、0.39±0.03，选取干扰效率最高的si-1组进行后续研究（n=3，F=1 010.014，P＜0.05），见图 2。平板克隆实验显示，干扰TRAP1的表达（NC、si-1组分 别 为 81.00±3.61、25.67±2.08）可 以 明 显 降 低SW480 细胞的克隆形成能力（n=3，t=23.020，P＜0.05），见图3A。CCK8结果显示干扰TRAP1的表达可以显著降低SW480 细胞的增殖能力（n=3，F组间=160.630，F时间=775.226，F交互=16.355，P＜0.05），见图3B。

Fig.2 The efficiency of TRAP1 siRNAs detected by Western blot assay图2 TRAP1干扰效率的检测

Fig.3 The effect of TRAP1 on the proliferation of CRC cells图3 TRAP1对CRC细胞增殖能力的影响

2.3 TRAP1 对CRC 细胞周期和凋亡的影响 流式细胞检测结果显示，干扰TRAP1 的表达后可以将SW480细胞周期阻滞在G0/G1期（P＜0.01），见表2，图4A，并且增加细胞凋亡（NC组、si-1组细胞凋亡率分别为 5.80%±0.70%、9.73%±0.68%；n=3，t=6.977，P＜0.01），见图4B。

Tab.2 The effect of TRAP1 on cell cycles表2 TRAP1对CRC细胞周期的影响 （%，）

Tab.2 The effect of TRAP1 on cell cycles表2 TRAP1对CRC细胞周期的影响 （%，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别NC组si-1组t n33 G0/G1期47.75±2.17 59.01±1.14 7.951＊＊S期17.31±0.92 12.41±1.25 5.480＊＊G2/M期34.94±1.27 28.58±1.25 4.413＊

2.4 TRAP1 对增殖、凋亡相关指标及PI3K/AKT 通路的影响 Western blot结果显示，干扰TRAP1的表达后，细胞周期相关蛋白CyclinD1 表达降低（P＜0.01），见图5A，表3；凋亡相关蛋白Cleaved-Casp3表达增加（P＜0.05），见图5B，表3；p-PI3K 和p-AKT表达降低（P＜0.01），PI3K/AKT 通路被抑制，见表4，图6。

3 讨论

Fig.4 The effects of TRAP1 on cell cycles and cell apoptosis图4 TRAP1对CRC细胞周期和凋亡的影响

Fig.5 The effects of TRAP1 on CyclinD1 and Cleaved-caspase 3 protein expressions图5 TRAP1对CyclinD1和Cleaved-caspase 3蛋白表达的影响

Tab.3 The effect of TRAP1 on CyclinD1 and Cleavedcaspase 3 protein expressions表3 TRAP1对CyclinD1和Cleaved-caspase 3蛋白表达的影响 （）

Tab.3 The effect of TRAP1 on CyclinD1 and Cleavedcaspase 3 protein expressions表3 TRAP1对CyclinD1和Cleaved-caspase 3蛋白表达的影响 （）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别NC组si-1组t n33 CyclinD1 1.33±0.05 0.86±0.05 11.853＊＊Cleaved-Casp3 1.10±0.03 2.07±0.08 18.925＊Casp3 1.28±0.03 1.27±0.03 0.411

CRC 治疗是全世界面临的难题，前期笔者团队针对CRC 开展了相关基础研究，发现转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）是诱导 CRC EMT 和转移的重要因子，而二苯乙烯苷可通过抑制PI3K/AKT通路，拮抗TGFβ介导的肿瘤转移效应，因此二苯乙烯苷有望通过抑制PI3K/AKT 通路应用于CRC 治疗［6］。除了肿瘤转移，肿瘤细胞的恶性增殖和凋亡抵抗也是介导CRC 患者不良预后的重要原因。因此探索肿瘤增殖和凋亡相关基因，有望为治疗CRC提供新的方法。

为了进一步寻找CRC 肿瘤相关基因，本研究通过生物信息学分析成功筛选出TRAP1 是CRC 潜在的癌基因。回顾既往研究，TRAP1 在多种肿瘤中高表达。Ou等［7］发现TRAP1在食管癌中表达升高，与患者淋巴结转移密切相关，并可通过激活STAT3/MMP2 信号通路，促进食管癌细胞的迁移和侵袭。在甲状腺癌中，TRAP1 的表达随着恶性程度增加而增加，通过调控ERK信号通路促进甲状腺癌细胞的增殖、抑制凋亡［8］。值得注意的是，TRAP1除了扮演促癌基因角色外，也在部分肿瘤中低表达，从而发挥抑癌作用。Yin 等［9］研究证实 TRAP1 在胶质母细胞瘤中表达降低，并调控肿瘤细胞侵袭与凋亡。目前TRAP1 在 CRC 中的作用已初见报道，Pak 等［10］研究发现过表达TRAP1可能导致CRC细胞的局部侵袭，其表达与CRC侵袭深度和不良预后相关。Han等［11］通过免疫组化检测结直肠癌手术标本中的TRAP1和切除修复交叉互补基因1（ERCC1）的表达，发现TRAP1 与ERCC1 表达的高低可预测CRC 对奥沙利铂和5-氟尿嘧啶（5-Fu）的化疗敏感性。但目前TRAP1 在CRC 中作用的研究大部分处于基因表达水平，缺乏基础实验依据，其在CRC 中的表达和生物学功能仍需进一步挖掘。

Tab.4 The effect of TRAP1 on PI3K/AKT pathway of SW480 cells表4 SW480细胞中TRAP1对PI3K/AKT信号通路的影响 （）

Tab.4 The effect of TRAP1 on PI3K/AKT pathway of SW480 cells表4 SW480细胞中TRAP1对PI3K/AKT信号通路的影响 （）

＊＊P＜0.01

组别NC组si-1组t n33 p-PI3K 1.19±0.02 0.57±0.03 36.454＊＊PI3K 0.18±0.02 0.43±0.02 0.690 p-AKT 1.14±0.01 0.72±0.01 57.277＊＊AKT 0.45±0.01 0.45±0.02 0.702

Fig.6 The effect of TRAP1 on PI3K/AKT pathway图6 TRAP1对PI3K/AKT信号通路的影响

本研究多层次检测了TRAP1 的表达，发现TRAP1在CRC组织中的蛋白表达水平显著升高，同样，与NCM460细胞相比，TRAP1在CRC细胞中的表达也更高。文献报道TRAP1 可调控肿瘤细胞增殖和凋亡进程［12-13］。本研究也针对该生物学行为进行观察，在SW480 细胞中干扰TRAP1 后，肿瘤细胞的增殖能力和克隆形成能力明显减弱；流式细胞术检测发现干扰TRAP1后SW480细胞周期阻滞在G0/G1期，并且凋亡增加；同时，细胞周期相关蛋白CyclinD1 表达降低，而凋亡相关蛋白Cleaved-Casp3表达增加，说明TRAP1 可以促进CRC 细胞增殖、抑制CRC细胞凋亡，是CRC的癌基因。

肿瘤细胞信号传导与肿瘤细胞恶性生物学行为密切相关［14］，其中，PI3K/AKT 信号通路是与肿瘤增殖和凋亡最相关的信号通路之一［15］。笔者前期针对PI3K/AKT 的通路及其潜在抑制药物已经开展了相关基础研究［6］，另有研究也证实TRAP1抑制剂SNX-2112 可抑制AKT 通路及其下游核因子（NF）-κB 的活性［16］。本研究通过Western blot证实，干扰TRAP1后，CRC 细胞 PI3K 和 AKT 磷酸化水平显著降低，进而支持TRAP1 可正向调控PI3K/AKT 信号通路，因此推测其对CRC 细胞增殖和凋亡的影响可能是通过PI3K/AKT信号轴来发挥的。

综上，本研究证实TRAP1 是CRC 的癌基因，在CRC 中高表达，可促进CRC 细胞增殖而抑制其凋亡，其潜在机制与TRAP1 激活PI3K/AKT 通路相关，为针对TRAP1 设计PI3K/AKT 通路抑制剂和抗肿瘤药物提供了实验证据。