肥大细胞在IgA 肾病中的表达及致病机制

王思远 严 苗 苏 可 陈 铖

IgA 肾病( IgA nephropathy，IgAN) 为临床常见的一种肾脏疾病，15% ～40%患者最终进展至终末期肾衰竭［1］。小管间质病变是影响IgAN 进展和预后的重要因素之一［2］。目前已有文献报道IgAN 患者肾间质存在肥大细胞浸润，且肥大细胞数量与肾纤维化程度存在正相关关系［3］。但亦有报道发现，肥大细胞可以通过调节炎性细胞浸润并抑制去分化减轻肾脏纤维化［4］。本研究通过分析肥大细胞在IgAN 及其合并肾功能不全患者肾组织中的表达，并对其作用机制进行探讨。

材料与方法

1.病例选取：肾脏标本来源包括：外伤或肾肿瘤肾切除患者的正常肾组织12 例( 正常组) ，IgAN 患者20 例( IgAN 组)及IgAN 合并肾功能不全( 血Cr 值＜200μmol/L) 患者8 例( IgARI 组) 。IgAN 组及IgARI 组标本来源于根据临床指征进行的肾活检术。对所有肾组织所进行的处理和使用均遵循国家伦理准则。诊断由肾脏病理医师根据班夫分类系统完成。

2.肾组织肥大细胞染色和计数：4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后用0.1%甲苯胺蓝染色。肥大细胞的计数由两名研究者分别独立完成，并记录为“计数/平方毫米”。

3.细胞的培养： 人肥大细胞系( HMC -1) 购买自青岛博康生物技术有限公司，细胞完全培养基为含有10%胎牛血清( 美国Gibco 公司) ，50μmol/L 1 -硫代甘油( 美国Sigma 公司，M6145) 的IMDM 培养基( 美国Gibco 公司) ，在37℃，5%CO2条件下进行培养。体外培养的肥大细胞分为3 组： 正常组，IL-6 刺激组(10ng/ml 美国Peprotech 公司) 及TNF -α 刺激组(20ng/ml 美国Gemini Bio-products 公司) 。HMC-1 细胞以2 ×105/ml 的密度在无血清培养基中培养6h 后添加相应刺激，分别在4、8 及24h 3 个时间点收集细胞，并在24h 收集无刺激因素肥大细胞设为正常对照组。

4.实时定量PCR 检测肾素mRNA 表达：Trizol 法提取HMC-1 细胞总RNA，分离出的RNA 样品通过Nanodrop 检测RNA 的纯度及含量，ExScriptTMRT 试剂盒合成cDNA 后，采用Taqman 探针技术进行实时定量PCR。肾素探针来源美国life technology 公司，商品号Hs00982555_m1。以GAPDH 设为内参照。

5.免疫印迹法检测肾素蛋白表达： 用含有Cocktail( 美国Sigma-Aldrich 公司) 的细胞裂解液(0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，1%Triton X -100，1mmol/L 苯甲磺酰氟，150mmol/L NaCl，20mmol/L Tris，pH 7.5，5mmol/L 依地酸) 裂解细胞，13000 ×g 4℃离心，取上清，BCA 法测定蛋白浓度，取等量蛋白12%SDS -PAGE 凝胶电泳，转膜至硝酸纤维素膜( 美国GE Heathcare 公司) ，一抗分别为肾素兔来源多克隆抗体(1∶200，美国Santa Cruz 公司) ，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10000，美国CST 公司) ，ECL( 美国Santa Cruz 公司) 反应，Geldoc( 美国Biorad 公司) 扫描硝酸纤维素膜，之后采用蛋白剥离缓冲液孵育硝酸纤维素膜30min，常规封闭液封闭后，与GAPDH 小鼠单克隆抗体(1∶20000，美国Santa Cruz 公司)常温孵育2h，相应二抗反应后再次显现扫描，应用Gel -Pro Analyzer 4.5 软件进行积分吸光度( A) 分析。

结 果

1.人肾组织肥大细胞染色计数： IgAN 组( 1.890±0.578 个/平方毫米) 及IgANRI 组( 5.450 ±1.435个/平方毫米) 较正常组( 0.230 ±0.187 个/平方毫米) 肥大细胞均增高( P =0.000) ，IgANRI 组较IgAN组肥大细胞数亦增高( P =0.000) 。肥大细胞主要分布于肾间质，特别是纤维化区域。血管球区域及小管管腔未见肥大细胞。肥大细胞计数与小管萎缩、间质纤维化、球性肾小球硬化存在相关关系( 图1) 。

图1 人肾组织肥大细胞计数( 甲苯胺蓝染色，×400)

2.肾素的定量：正常培养的肥大细胞即可产生肾素mRNA 及蛋白，IL -6 刺激组及TNF -α 刺激组肾素的表达较正常组肾素的表达明显增多，并呈时间依赖性升高( P ＜0.05，图2) 。

讨 论

IgAN 好发于青少年，男性多见，以肾小球系膜基质与系膜细胞增殖和( 或) 单核细胞浸润为特点，包括4 项主要病理指标：系膜细胞增生、内皮细胞增生、节段性硬化或粘连及肾小管萎缩或肾间质纤维化。近年的研究证实，系膜细胞分泌炎性因子、活化补体在导致IgA 肾病的病理改变和临床症状中起重要作用［5］。但其具体的发病机制尚未完全阐明，积极寻找IgAN 致病因素及探讨可能的干预因素对指导临床治疗有重要意义。

在IgAN 中，肾小管间质病变较小球病变与疾病的进展联系更加紧密［6，7］。研究发现小管间质浸润的肥大细胞数量可能是判断IgAN 预后的指标之一［3］。并且肥大细胞可通过多种机制参与肾纤维化的过程［8］，如：肥大细胞分泌的TGF-β1 已被证实可通过诱导上皮细胞去分化从而促进纤维化的发生［9］。但亦有研究表明，肥大细胞缺陷小鼠肾脏α-SMA表达较野生型小鼠明显增加，提示肥大细胞抑制肾脏的纤维化［4，6］。本研究收集临床肾活检标本，发现IgAN 及IgAN 肾功能不全患者肾间质存在肥大细胞浸润，且肥大细胞的数量与小管萎缩、间质纤维化、球性肾小球硬化等存在相关关系。提示干预肥大细胞浸润至肾组织可能延缓IgAN 患者疾病的进展，减缓肾功能减退。

图2 肥大细胞肾素的定量

肾素-血管紧张素系统( RAS 系统) 尤其是局部RAS 系统的激活在慢性肾脏损伤中发挥重要作用［10］。有报道发现，IgAN 中，肾间质浸润的肥大细胞在血管紧张素Ⅱ阳性细胞团周围聚集，血管紧张素Ⅱ阳性细胞计数与肥大细胞计数呈相关关系，并同时发现，肥大细胞本身并不能表达血管紧张素Ⅱ［11］。提示肥大细胞与局部RAS 激活存在一定联系。最近研究发现，缺血再灌注损伤中，心肌肥大细胞分泌肾素，激活RAS 系统，从而引起心率失常的发生［12，13］。本研究通过体外培养肥大细胞，采用实时定量PCR及免疫印迹两种方法证实，肥大细胞可表达肾素基因及蛋白，可参与局部RAS 系统的激活。并且，在炎性因子IL-6 和TNF -α 刺激下，肥大细胞肾素mRNA及蛋白的表达呈时间梯度增加。提示IgA 肾病中，系膜细胞分泌的炎性因子可通过增加肥大细胞肾素的表达，加重病理改变。对IgAN 的发病机制进行了进一步的阐明。

综上所述，肥大细胞在IgAN 的疾病进展中起促进作用。其中，系膜细胞分泌炎性因子刺激肥大细胞表达肾素，激活RAS 系统，导致进一步的病理改变和临床症状。减轻炎性反应、干预肥大细胞浸润至肾组织及调节局部肾素表达可能是IgAN 患者治疗的新靶标。

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10 Ferrao FM，Lara LS，owe J.Renin-angiotensin system in the kidney：What is new? ［J］. World J Nephrol，2014，3(3) ： 64 -76

11 Aldi S，Takano K，Tomita K，et al. Histamine H4 - receptors inhibit mast cell renin release in ischemia/reperfusion via protein kinase C epsilon-dependent aldehyde dehydrogenase type-2 activation［J］. J Pharmacol Exp Ther，2014，349(3) ： 508 -517

12 Aldi S，Marino A，Tomita K，et al. E - NTPDase1/CD39 modulates renin release from heart mast cells during ischemia/reperfusion： a novel cardioprotective role［J］. FASEB J，2014 ( Epub ahead of print)

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