一种新型阳性对照在病理特殊染色中的尝试

周嫔 徐伟铭 叶恩如 张玲娜

特殊染色已经开展了100多年，常用于显示在HE染色中难以观察或观察不到的组织成分（如结核杆菌、真菌、网状纤维等），是临床病理诊断重要的辅助技术。特殊染色过程复杂，影响因素多，设立合适的阳性对照是特殊染色质量控制的关键。归档人体组织蜡块是特殊染色最常用的阳性对照，但存在与检测组织混淆的可能，尤其是切片外借会诊时，有可能误判。目前给每例特殊染色设立阳性对照的实验室不多。笔者尝试用市售高活性酵母菌和蛋清的混合团块制成蜡块，用于作为显示真菌的特殊染色的新型阳性对照。以常用过碘酸希夫染色（PAS染色）和六胺银染色为例，现介绍如下。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 珠海贝索生物技术有限公司PAS染色、六胺银染色试剂盒，日本樱花全封闭组织脱水机VRP-6，日本樱花组织包埋机，德国莱卡石蜡切片机。

1.2 对照蜡块制作

1.2.1 活性酵母菌备用 市售安琪高活性干酵母菌0.05 g，溶于1 ml温蒸馏水中。

1.2.2 制备蛋清基质 取1只新鲜鸡蛋或鹌鹑蛋，用一次性吸管吸出蛋清置于烧杯中，搅拌均匀，包上保鲜膜，冰箱冷藏备用。

1.2.3 酵母菌蛋清混合团块制备 在酵母菌溶液中滴加200～300倍体积的蛋清，用震荡器混匀。沿离心管管壁缓缓加入95%乙醇溶液40 ml，静置30 min，2 500 r/min离心5 min，倒去上清液，沿离心管管壁缓缓加入10%中性甲醛溶液 40 ml，固定 6～8 h，2 500 r/min 离心 5 min，倒去上清液，留沉淀物备用。

1.2.4 组织脱水包埋 将酵母菌蛋清混合团块用胃镜纸包好，装入包埋盒中，在脱水机中脱水，透明，浸蜡。在自动包埋机操作台打开包埋盒，用镊子将酵母菌蛋清混合团块夹均。在小号铁皮模具里加少量石蜡，置于加热台上，用镊子夹取适量酵母菌蛋清混合团块放进模具里搅拌均匀，将模具盖上包埋盒，再加入适量石蜡后转移至冻台稍冷却，将蜡块倒扣，轻敲脱模。

1.2.5 制作对照切片 用石蜡切片机将阳性对照蜡块按3 μm厚度连续切片，将切片移至摊片机中。对照切片贴于载玻片右侧，置于染色架上晾干，储存于干燥切片盒内备用。将切好的检测组织统一贴在对照切片的左侧，放入60℃烤箱中烤片过夜。

1.3 实验方法

1.3.1 PAS染色 切片脱蜡至蒸馏水，1%高碘酸滴染10 min，蒸馏水冲洗，擦干组织周边水分，将切片置于湿盒中，PAS染液滴染15 min，流水洗10 min，Mayer苏木素复染1 min，水洗，蓝化，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3.2 六胺银染色 切片脱蜡至蒸馏水，1%高碘酸氧化15 min，蒸馏水冲洗2 min，六胺银染液（临用前配制，水浴箱预热15 min）于62℃水浴箱内浸染30 min左右（镜下控制染色情况），蒸馏水洗，0.2%氯化金溶液滴染30 s，水洗，5%硫代硫酸钠滴染3 min，水洗，伊红复染30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结果

将新型阳性对照应用于本科室2019年9至12月120例肉芽肿组织特殊染色，新型阳性对照染色结果准确，菌体分布合理，背景干净清晰，极易鉴别，加快了病理医生阅片时对特殊染色质量的评估。对比图1-2发现检测组织和阳性对照的阳性菌染色鲜艳程度接近。预切的对照玻片连续使用3个月，染色结果一直稳定可靠，未出现脱片现象。

图1 过碘酸希夫染色（PAS染色）所见（a：检测组织PAS染色，新型隐球菌荚膜呈亮丽的紫红色，背景干扰因素多；b：新型对照组织PAS染色，酵母菌呈圆形或类圆形，紫红色，背景清晰；PAS染色，×400）

图2 六胺银染色所见（a：检测组织六胺银染色，新型隐球菌荚膜呈黑褐色，背景较清晰；b：新型对照组织六胺银染色，酵母菌呈黑褐色，背景清晰；六胺银染色，×400）

3 讨论

随着近年来各种高效广谱抗生素、免疫抑制剂及抗恶性肿瘤药物的广泛使用，再加上器官移植、导管技术以及外科其他介入性治疗的全面成熟与发展，导致因条件致病性真菌所引起的系统性真菌感染日益增多[1]。由于真菌在组织中用HE染色一般着色较浅或不着色，观察比较困难，尤其是在真菌数量较少或菌体较小的情况下更难辨认。只有当真菌数量多到一定程度时常规HE染色才比较容易鉴别，故漏诊概率很大[2]。此外即便HE染色切片中有时即可见真菌，还需进行特殊染色如六胺银染色、PAS染色以明确诊断[3]。

有时染色结果与临床考虑不一致时，医师常常怀疑特殊染色步骤是否正确，染色试剂是否可靠，因此在检测组织旁设置阳性对照可以证明染色结果的可靠性。笔者通过反复摸索实验，发现蛋清既能凝聚酵母菌又能稀释酵母菌，还能增加对照组织与玻片的亲和力，避免脱片，是一个良好的添加剂。阳性对照以400×视野下见50个左右阳性菌为佳，既方便查对又避免细菌堆叠。随机对比30例检测组织和对照组织，两者阳性菌染色鲜艳程度接近。

新型阳性对照具有以下优点：（1）检测组织与对照组织在同一玻片上，保证检测条件的一致性。（2）避免归档蜡块的消耗。人体深部肉芽肿多数采用细针穿刺组织进行病理检测，组织量少，应尽可能保存组织，以便后期可以进一步检测。（3）制作简便、来源广泛。市售高活性干酵母菌和蛋清等都是生活常用品，容易获得。（4）结果稳定，有效期长。预切一批对照玻片，使用3个月，染色结果持续稳定。对照蜡块可存放数年。（5）对照组织占位小（5 mm×5 mm），且无结缔组织结构，与检测组织界限清楚，不易混淆，镜下阳性菌分布均匀，数量适中，染色和形态结构典型，方便阅片和查对。

综上所述，用酵母菌和蛋清制作的新型阳性对照优点较多，值得推广。