酵母抽提物对小黄鱼边角料腥味脱除研究

欧阳伟虹， 胡 伟， 周旭静， 孙武千， 刘利萍*

（1. 浙江万里学院 生物与环境学院，浙江 宁波315100；2. 宁波兰洋水产食品有限公司，浙江 宁波315731）

小黄鱼属低值鱼类，但风味鲜美，富含人体所需的多种营养成分，食用价值高。 在小黄鱼产品的生产过程中会产生大量的小黄鱼边角料，即带头和内脏的鱼排。 鱼排含有大量的蛋白质和丰富的钙，直接废弃浪费水产资源污染环境，充分利用小黄鱼加工后的边角料显得尤为必要，但受限于其带有腥味、泥土味等不良风味，往往难以进一步加工利用，因此需要对小黄鱼边角料脱腥方法和脱腥机制进行研究。 目前国内外关于水产品脱腥的研究[1]主要集中在腥味物质的确定、脱腥方法的开发、脱腥条件的优化等方面。

腥味物质主要来源于厌氧菌对氧化三甲胺、氨基酸和肽的降解、脂肪氧化、含硫氮前体物质转化、鱼体对环境腥味物质吸入和摄入的低相对分子质量的醛、醇、酮、硫醚等[2]。 比如鱼皮和内脏含有较多的微生物和酶类，会将碱性氨基酸等腥气特征化合物前体物质分解产生短链的腥气成分[3]；羧酸与氨或胺缩合形成酰胺化合物如N，N-二甲基丙酰胺，此化合物具有明显的鱼腥味。 而目前腥味物质的确定主要通过HS-SPME-GC-MS 分析技术， 如沈丽等[4]通过分析鲫鱼的挥发性风味物质，鉴定出23 种挥发性成分；Yo-shiwa[5]研究沙丁鱼的特征腥味物质，证实2，4-庚二烯醛、3，5-辛二烯醛、2，4-癸二烯醛和2，4，7-癸三烯醛是沙丁鱼的主要腥味物质。章超桦[6]认为新鲜鲫鱼所具有的特征气味主要是1-戊烯-3-酮、2，3-戊二酮、1-戊烯-3-醇、 己醛、 反-2，顺-4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、1，5-辛二烯-3-醇等， 而这些挥发性成分的协同作用构成了草腥味、泥土味等鲫鱼特有的鱼腥味。 揭珍等[7]从新鲜带鱼营养成分及风味物质的研究中检测出并证实具备腥味的挥发性成分主要三甲胺和醇类化合等。

目前主要的脱腥方法有物理法、化学法和生物法[8-9]，通过这些方法可以尽量避免或减缓鱼体脂肪的氧化，或吸附、消除和掩盖鱼腥味。 物理法主要是用活性炭吸附和环糊精包埋；化学法主要是用酸碱或天然草本植物提取液处理； 生物法主要是乳酸菌、酵母菌发酵。 传统的物理掩盖难以彻底清除腥味， 化学法脱腥会夹入化学物质增加食物毒性，生物法脱腥易损失蛋白、增加异味。 天然抗氧化剂法是众多方法中有效且安全的，但使用抗氧化剂脱腥会随季节变化、产品种类的不同而存在差异。 酵母抽提物是食用酵母经过自溶、酶解、分离、浓缩等工艺制备而成，成分为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B 族维生素及微量元素，既营养又安全。 目前酵母抽提物多用作食品风味的调节剂和改善剂， 如郭辉等[10]在料酒中添加UMAMI 型酵母抽提物， 显著提升了料酒的风味品质，刘通讯等[11]将酵母抽提物应用于酱油，有效改善了酱油品质，但其应用于水产品脱腥方面的报道还较少，机理尚未明确。

作者通过电子鼻和感官评定评价酵母抽提物脱腥、化学脱腥、发酵脱腥以及姜葱料酒醋脱腥等不同脱腥方法对小黄鱼边角料的脱腥效果，结合三甲胺的测定和HS-SPME-GC-MS 研究酵母抽提物的脱腥机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

材料：小黄鱼边角料（规格为体长（15.43±2.68）cm，质量（20.37±4.56）g），由宁波兰洋水产食品有限公司提供。

酵母抽提物（安琪活性干酵母）：安琪酵母股份有限公司产品；川秀乳酸菌：北京川秀贸易有限公司产品；苦味酸、甲苯、无水碳酸钾、甲醛、无水硫酸钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、盐酸三甲胺（分析纯）：均为国药产品；生姜、料酒、醋，市售。

20 mL 顶空自动进样圆底瓶： 上海安谱科学仪器有限公司产品；SPME-萃取头（选用65 μm PDMS萃取装置）：上海安谱实验科技有限公司产品；7890 BGC-MS 联用仪：Agilent Technologices 公司产品；T6 紫外分光光度计： 北京普析通用仪器产品；QL-861 漩涡混合仪：上海漩涡混合器厂制造；6-16K 低速大容量冷冻离心机：Sigma 公司产品；PEN 3 电子鼻：德国AIRSENSE 公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 不同脱腥剂脱腥效果测定将冷冻小黄鱼边角料在常温下解冻，去内脏，清洗沥干，照表1 配制脱腥液，鱼与脱腥液质量比为1∶2，混合打碎，按表1 中脱腥温度脱腥1 h，去除脱腥液，鱼肉备用。

1） 脱腥鱼肉气味与盐酸三甲胺气味区分 将脱腥后的鱼肉100 目过滤，4000 r/min 离心5 min，弃上清液。称取5 g 鱼肉于20 mL 顶空瓶中，室温平衡30 min。电子鼻清洗40 s，数据采集时间120 s。盐酸三甲胺作为标准物质进行比较。取平稳状态113～115 s 的测量数据作为分析的点， 采用PEN3 自带Win Muster 数据处理软件主成分分析法（PCA）进行数据分析。

表1 脱腥液及脱腥温度Table 1 Deodorization liquid and temperature

2）脱腥鱼汤风味评价[12-13]由15 位本项目研究人员和研究生组成，人员筛选与培训方法参照国家标准。 鱼肉脱腥后熬煮成鱼汤，加适量的盐进行感官评定（包括腥味、鱼香味、鲜味、苦味、涩味），按0～10 分打分：0 为无明显气味；2 为刚好可识别；4 为弱；6 为中等；8 为强；10 为很强。 感官评分采用均值进行表述。

1.2.2 酵母抽提物脱腥工艺优化

1） 脱腥温度对脱腥效果的影响 在鱼糜中添加质量分数0.5%脱腥剂混匀，将混合好的鱼糜平均分成5 份， 分别于4、10、20、30、40 ℃温度下水浴60 min，然后取10 g 脱腥的小黄鱼鱼糜放入50 mL离心管中， 加入20 mL 质量分数10%三氯乙酸，振荡1 min，4000 r/min 离心5 min，过滤。 重复1次，合并滤液并定容至50 mL。 测定方法同国标三甲胺（TMA-N）测定[14]：计算公式如下：

式中：A 为待测液的吸光值；TMA-N 为三甲胺氮质量分数。

2） 脱腥时间对脱腥效果的影响 在鱼糜中添加质量分数0.5%的脱腥剂并混匀，将混合好的鱼糜平均分成5 份， 相同温度下处理0、15、30、60、120 min，三甲胺测定方法同上。

3） 脱腥剂质量分数对脱腥效果的影响 取等质量的鱼糜4 份， 分别添加质量分数0.2%、0.5%、1%、2%的脱腥剂于相同温度下处理60 min，三甲胺测定方法同上。

4）三甲胺溶液标准曲线的制作 制备10 μg/mL三甲胺标准溶液，依次吸取0.5、1、2、3、4 mL 三甲胺标准溶液，加水定容至5 mL，于510 nm 处测定其吸光值，绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.0789 x-0.0111，r ＝0.9975，其质量浓度范围为（1～8 μg/mL）。

5） 最佳脱腥工艺的确定 根据单因素脱腥实验结果，选取脱腥剂、脱腥时间和脱腥温度因素，采用SPSS Statistics17.0 软件设计正交实验，以三甲胺质量分数为指标，确定脱腥的最佳工艺。 见表2。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 小黄鱼脱腥前后挥发性风味物质的测定采用HS-SPME-GC-MS 对未脱腥和优化脱腥后鱼糜进行挥发性物质测定。 样品处理同“1.2.1 项”，取5 mL 鱼汤于20 mL 顶空瓶加2 g NaCl， 压盖密封，待测。

顶空固相微萃取条件： 萃取头为DVB/PDMS，萃取温度为60 ℃，平衡时间10 min，萃取时间40 min，解析温度250 ℃，解析时间50 min 。

气质分析条件：色谱条件：色谱柱为DB-1 弹性毛细管柱（60 m × 320 μm × 0.5 μm）；升温程序：柱温于40 ℃保持1 min 后，以5 ℃/min 升至120 ℃保持1 min，再以6 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min；以He 为载气，流速为2 mL/min；分流比1∶10。 质谱条件：EI 电离源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；四级杆温度150 ℃；检测器温度300 ℃；质量扫描范围m/z 353～350。

挥发性风味物质分析： 气相色谱-质谱检测结果通过计算机检索，利用NIST 14 谱库相互匹配进行定性分析。 仅对谱库中化合物相似度大于80（ 最大值为100）的组分进行处理，去除其中的硅氧烷类杂峰和一些非嗅觉类物质峰。 腥味评定方法[1，15-17]：以面积归一化法计算具有海腥味的1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇、N，N-二甲基丙酰胺、三甲胺、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛等11 种腥味物质的峰面积， 未脱腥的鱼肉风味分析所得的42 种物质总峰面积记为1。

2 结果与讨论

2.1 不同方法脱腥效果

2.1.1 电子鼻响应值及PCA 分析结果相对于未处理组，经过脱腥剂处实验组都有不同程度的脱醒效果，在同一传感器下分析不同的脱腥处理组处理效果，见图1。响应结果图中酵母菌处理组电子鼻响应值最大，可能酵母的独特气味能够掩盖鱼汤的气味，也可能是酵母在脱腥过程中发酵产物的影响导致[18]。 各处理方法气味在氮氧化物、甲烷、无机硫化物、乙醇、有机硫化物的传感器上具有明显区分，而蛋白质腐败过程中，蛋白质产生胺类、硫化氢、甲烷等，脂肪产生低分子脂酸醇等，糖类产生低级脂肪酸、二氧化碳、甲烷、氢气等物质[19]，通过此可知氮氧化物、甲烷、无机硫化物、乙醇、有机硫化物是组成腥味的重要物质。 在这几个传感器上酵母抽提物、pH 3 盐酸、pH 9 氢氧化钠处理组响应值较其他组别明显减小，说明甲烷、无机硫化物、乙醇、有机硫化物均有所减少， 酵母抽提物减少了蛋白质的腐败、延缓了脂肪和糖类的降解。

图1 不同脱腥方法处理后电子鼻响应峰值Fig. 1 Peak response of electronic nose of samples by different deodorization treatments

图2 不同脱腥方法下小黄鱼气味与三甲胺的PCA 分析Fig. 2 Principal component analysis of Polyactis scraps and trimethylamine

如图2 该图总贡献率大于85%，能反映原数据信息。 各实验组与未脱腥组有明显区分，除酵母抽提物组外其他组别与标准物质三甲胺未能完全区分。 相对于其他脱腥脱腥方法酵母抽提物组对三甲胺的脱除效果最明显。2.1.2 感官评定结果从图3 感官评分得知1 g/dL酵母菌处理组、0.5 g/dL 酵母抽提物处理组和未处理组鱼香味的得分较高；0.5 g/dL 酵母抽提物处理组鲜味出众；姜葱料酒组，0.5 g/dL 酵母提物组以及pH 为9 氢氧化钠处理组苦味、涩味、腥味较轻。

图3 感官评价雷达图Fig. 3 Radar map of sensory evaluation

2.1.3 脱腥效果综合结果电子鼻测定结果和感官评定结果中脱腥效果较好的前3个组别中都有酵母抽提物脱腥组和氢氧化钠脱腥组， 结果一致。这2个脱腥组中酵母抽提物处理组腥味小、鲜味出众，未带入不良风味与其他脱腥剂相比作用条件更温和且对三甲胺有明显的影响。 因此，以三甲胺作为含量测定指标探究酵母抽提物最优脱腥工艺。

2.2 脱腥工艺优化结果

2.2.1 单因素实验图4（a）、（b）、（c）为酵母抽物提物单因素实验结果，从实验结果可知，随温度的升高三甲胺的质量分数呈现先下降在升高的趋势，在20 ℃时三甲胺质量分数低；随时间的增加三甲胺质量分数先迅速下降再缓慢增加，在60 min 三甲胺质量分数最低；随脱腥剂质量分数增加，三甲胺质量分数在脱腥剂质量分数为0.5%出现最低的拐点。单因素实验中酵母抽提物最佳脱腥条件为： 添加0.5 g/dL 酵母抽提物于(20±2) ℃中浸泡60 min。鱼体中的氧化三甲胺在微生物、酶、温度、时间、脱腥剂用量等多重因素下三甲胺生成速率大不相同。 样品本身黏度较大，低温时脱腥剂的渗透能力差，掩盖腥味的物质和与三甲胺反应的物质与鱼肉接触不充分，因此检测含量较高；随温度和脱腥剂质量分数和脱腥时间的升高，酵母抽提物在鱼糜中扩散充分，脱腥剂的呈弱酸性会中和部分三甲胺因此测定质量分数会减少；再随着脱腥剂、质量分数、时间的增加微生物的作用增强因此三甲胺质量分数又会缓慢增加。

图4 脱腥工艺单因素实验结果Fig. 4 Single factor test results of deodorization process

2.2.2 正交试验正交实验极差分析得出脱腥时间对酵母抽提物脱腥影响最大， 其次是脱腥温度，脱腥剂质量分数影响最小，见表3、表4。 由正交实验得到的最佳脱腥条件是添加1 g/dL 酵母抽提物于40 ℃浸泡60 min。

根据表5 结果， 未脱腥组三甲胺质量分数为13.73 μg/g； 单因素实验组三甲胺质量分数为4.57 μg/g，与未脱腥组相比下降了66.7%；正交实验组三甲胺质量分数为2.58 μg/g， 与未脱腥组相比下降81.2%， 说明不同的脱腥条件对脱除鱼糜中三甲胺质量分数有较大影响。

表3 正交优化试验结果Table 3 Orthogonal test results

表4 TMA 质量分数的极差分析结果Table 4 Range analysis results of TMA content

表5 单因素、正交实验TMA 质量分数对比Table 5 Comparison of TMA contents in single factor and orthogonal experiments

2.2.3 HS-SPME-GC-MS 分析脱腥前后挥发性物质变化采用HS-SPME-GTC-MS 对未脱腥小黄鱼鱼汤和酵母抽提物脱腥的小黄鱼鱼汤挥发性物质分析结果如表6。 黄鱼鱼汤的风味成分组成主要是醛类、烃类、醇类，少量酮类、芳香类化合物、含氮、含硫化物、脂类。 醛类、烃类、醇类是小黄鱼气味的主要组成物质，此外还有醛类物质多数来源于不饱和脂肪酸中碳碳双键氧化产生的降解产物，通常阈值较低， 能与其他物质叠加产生明显的风味效应，对产品的风味贡献较大[17]；烃类物质，由于其阈值相对较高，在整体的风味贡献方面作用较小[20]。醛类物质主要是由不饱和脂肪酸的氧化降解产生[21-24]。

表6 小黄鱼脱腥前后挥发性风味物质组成及峰面积Table 6 Composition and the content of volatile flavor and smellcompounds before and after deodorization of Polyactis scraps

续表6

未脱腥处理的鱼汤检出42 种物质， 正交脱腥后挥发性物质种类减少检出21 种成分。 腥味物质主要是醛类、醇类、胺类，而三甲胺是鱼体内的氧化三甲胺在微生物和酶的作用下降解生成，是鱼腥味重要呈现物质[4]。 比较未脱腥组、正交组中的三甲胺峰面积依次为136.22×104、68.45×104；以面积归一化法计算总的腥味物质峰面积占总峰面积的百分数，未脱腥组、正交组依次为23.5%、9.27%，上述腥味物质均呈现依次减小的变化，其结果与“2.2.2”项中三甲胺质量分数测定结果趋势一致。 另外，具有明显海腥味物质如N，N-二甲基丙酰胺、1-戊烯-3-醇、1 -辛烯-3-醇在单因素脱腥组、 正交脱腥组均未检出，这表明酵母抽提物能够与腥味物质发生反应减少腥味。

2.3 讨论

通过电子鼻结合感官评定发现酵母抽提物与其他脱腥方法一样具有明显脱腥效果，挥发性物质在脱腥前后有明显区分。 未脱腥组中的醛类和醇类含量较多，呈现出较重的腥味，其中己醛、庚醛、辛醛、N，N-二甲基丙酰胺、1-辛烯-3-醇和1-戊烯-3-醇等物质是鱼肉腥味的主要来源，脱腥后醛类物质和三甲胺物质大幅度减小， 而表征鱼体腥味的N，N-二甲基丙酰胺、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇等物质未检出。 这可能是由于酵母抽提物在腥味产生过程中其酸性氨基酸与胺或氨反应，从而减少了三甲胺的生成，且阻止了N，N-二甲基丙酰胺的产生。 此外其短肽具有一定的抗氧化活性，一定程度上减缓了脂肪的氧化，使得醇类减少，1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇未能形成。

3 结 语

作者先通过电子鼻和感官评定对酵母抽提物脱腥效果做一个初步了解，而后以三甲胺为指标通过正交实验确定最佳的脱腥工艺条件， 即鱼糜60 min 时脱腥效果最佳。 最后结合HS-SPME-GCMS 分析可知，经此条件脱腥后的小黄鱼边角料，其腥味物质相对峰面积从23.5%下降到9.27%。 脱腥后使鱼体呈腥味的N，N-二甲基丙酰胺、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇等物质均未被检出，酵母抽提物通过防止脂肪的氧化、中和部分胺类来脱除腥味。