野生蒙古口蘑多糖通过STAT3 和HIF-1α 通路对LPS 诱导的巨噬细胞发挥抗炎调节作用

于传宗， 张凤兰， 慕宗杰， 李子钦， 孙峰成， 郝丽珍*

（1 内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特010018；2. 内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特010031）

炎症是人体为保护自身免受外来环境侵害的防御系统[1]。 在炎症过程中，巨噬细胞通过释放前列腺素和促炎性细胞因子 （TNF-α、IL-6、IL-1α 和IL-1β）等，对有害物刺激物（如食物、病原体、药物）的侵扰做出反应，这一过程称为吞噬作用[2]。 在这个过程中，吞噬细胞会产生具有毒性的副产物，包括活性氧如一氧化氮（NO）、过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-），虽然这些炎症介质在机体防御机制中是必不可少的，但是过量的活性氧会对细胞的氧化应激产生压力， 引起的慢性炎症会持续地破坏组织。炎症已经被证明与各种疾病的发病机制有关，如糖尿病[3]、老年痴呆症[4]、心血管疾病[5]和癌症[6]。 已经有很多抗炎症的药物被开发并在临床获得应用，控制和回复异常的炎症。 目前主要的有2 类抗炎药，最主要且用量最大的非甾体类抗炎药， 如阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布等；甾体类抗炎药，如泼尼松、地塞米松等。 这些抗炎药的使用已被证明会诱发死亡[7]，也有研究表明非甾体类抗炎药的使用会引起肝损伤[8]。 寻找更有效安全的抗炎药，是研究的一个热点。 蒙古口蘑多糖提取物已经被证明具有抗炎症、抗氧化的作用[9]，然而其作用机制和作用途径仍然不清楚。 细菌内毒素（LPS）通过Toll样受体4 （toll-like receptor 4, TLR 4） 激活巨噬细胞，是慢性炎症巨噬细胞（RAW 264.5）的强效刺激物之一[10]，作者通过LPS 诱导RAW264.7 细胞，选取炎症与氧化应答相关的基因Hypoxia-induciblefactor1α （HIF-1α）、Nuclear factor-κB（NF-κB）、Signal transducer and activator of transcription3protein（STAT3）、Cyclooxygenase -2 （COX -2） 和Inducible nitric oxide synthase（iNOS）检测蒙古口蘑多糖影响细胞炎症反应，发挥抗炎作用的途径。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

Cell Counting Kit： 购自日本同仁化学-东仁化学科技 （上海） 有限公司；LPS，S-Methylisothiourea Sulfate（SMT）：购自Sigma-aldrich 公司；细胞RNA提取试剂盒： 购自北京天根生化科技有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，Maxima SYBR Green qPCR Master Mix： 购自Thermo Fisher公司；RPMI 1640 培养基： 购自BI 公司； 胎牛血清FBS：购自北京四季青生物科技有限责任公司；Anti-COX2 antibody： 购 自Abcam 公 司；HIF1α Rabbit Polyclonal antibody，NF-κB Rabbit Polyclonal antibody，STAT3 Rabbit Polyclonal antibody： 购自Proteintech公 司 ；Anti -GAPDH Monoclonal Antibody，HRP affinipure Goat Anti-Rabbit igG（H+L），HRP affinipure Goat Anti-Mouse igG（H+L）：购自Earthox 公司；超敏ECL 化学发光试剂盒：购自上海碧云天生物技术有限公司；Mouse IL-1β ELISA kit （小鼠白细胞介素-1β），Mouse TNF-α ELISA kit （小鼠肿瘤坏死因子-α）：购自欣博盛生物科技有限公司；引物：由上海生工生物工程股份有限公司合成。

ND-1000 型微量紫外分光光度计、 冻干机、普通PCR 仪：购自Thermo Fisher 公司；5430R 低温台式冷冻离心机：购自Eppendorf 公司；BG-power5000型稳压稳流电泳仪：购自北京百晶生物技术有限公司；实时定量PCR 仪：购自Bio-rad 公司；凝胶成像系统：购自GE Healthcare 公司等。

1.2 实验对象

蒙古口蘑采摘于内蒙古锡林郭勒草原， 切片，在（-50±3） ℃，冻干48 h，自动匀浆机匀浆后，取粉末100 g 加入体积分数80% 1 L 的乙醇， 室温3 d，上清液即为质量浓度100 g/L 的多糖提取物（Tricholoma mongolicum polysaccharide extract，TMPE）[11]。 小鼠巨噬细胞（RAW264.7），培养条件：1640 培养基、10% FBS、37 ℃、体积分数5% CO2。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞活力实验取对数期RAW264.7 细胞悬液接种于96 孔板，接种密度为5×105个/mL，每孔100 μL，12 h 后加入不同质量浓度的TMPE，TMPE的质量浓度设定为0、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL，每组6个复孔，加入10 μL CCK-8 进行细胞活力测定。

1.3.2 TMPE 抗炎效果检测实验取对数期RAW264.7 细胞悬液接种于96 孔板， 接种密度为5×105个/mL， 每孔100 μL，12 h 后加入LPS 刺激，设置空白对照组、LPS（1 μg/mL）组、LPS（1 μg/mL）+SMT（6 μmol/mL）组、LPS（1 μg/mL）+TMPE（0.01 μg/m）组、LPS（1 μg/mL）+TMPE（0.1 μg/mL）组、LPS（1 μg/mL）+TMPE（1 μg/mL）组、LPS（1 μg/mL）+ TMPE（1 μg/mL）组，每组6个复孔，作用24 h 后，收集上清液通过Griess 法测定上清液中的一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量[12]，Elisa 测定TNF-α、IL-1β 的含量。

1.3.3 RNA 的提取、 反转录及定量取对数期RAW264.7 细胞悬液接种于6 孔板， 接种密度为1×106个/mL， 每孔2000 μL，12 h 后加入LPS 刺激，设置空白对照组，作用12 h 后，收集细胞并提取RNA 和蛋白质，RNA 的提取按照北京天根生化试剂说明书进行， 所提RNA 通过微量分光光度计测定浓度。并用1.2 g/dL 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量， 按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kits 说明书进行反转录。 按照Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 说明书进行实时定量实验测定mRNA 表达量，引物退火温度均为60 ℃，至少5个复孔，其他参照说明书，采用2-ΔΔCt法进行数据表达量分析。 以GAPDH 作为管家基因，NCBI 中提供的mRNA成熟序列设计实时定量扩增引物。 引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.3.4 免疫印迹取对数期RAW264.7 细胞悬液接种于6 孔板，接种密度为1×106个/mL，每孔2000 μL，12 h 后加入LPS 刺激， 设置空白对照组，作用12 h 后，提取蛋白质，采用BCA 蛋白质定量试剂盒检测总蛋白质的浓度，SDS-PAGE，转膜，封闭，抗体孵育，ECL 显色。

1.4 数据统计分析

用SPSS19.0 对试验数据进行统计分析，所有试验结果数值均用平均值±标准误差表示。 选用单因素方差分析（ANOVA LSD），DUNCAN 多重比较和双变量相关分析。

2 结果与分析

2.1 检测结果

2.1.1 细胞活力检测在测定TMPE 的抗炎活性前，先对TMPE 对细胞的影响进行评估，表2 显示与未经处理的细胞对照组（0 质量浓度）相比，不同质量浓度的TMPE 对RAW264.7 作用不同。 在质量浓度0.01～10 μg/mL 的TMPE 测试范围内观察到的细胞存活率随着剂量增加而增加，在TMPE 最大质量浓度为100 μg/mL 的时候，细胞存活率与对照组相比会显著降低（P＜0.05），该浓度的细胞存活率仅为62%。在TMPE 质量浓度为0.1、1、10 μg/mL 时与对照组相比细胞存活率显著增加（P＜0.05），在10 μg/mL 时TMPE 显示出最高的存活率（172%）。

2.1.2 TMPE 对NO 生成的影响通过测试TMPE对NO 生成的抑制效果，验证TMPE 的抗炎活性，结果显示如图1。 从图中可以确定LPS 诱导的RAW264.7细胞，NO 的生成量相比对照组显著增加（P＜0.05），在LPS 诱导的RAW264.7 细胞模型中加入不同质量浓度的TMPE （0.01、0.1、1 μg/mL 和10 μg/mL），NO 的产生量相比LPS 模型组均显著降低（P＜0.05）（抑制率分别是38.21%、64.17%、58.16%和79.42%）。SMT（强的iNOS 抑制剂）显著地降低了LPS 诱导的RAW264.7 细胞NO 产量（P＜0.05）（抑制率为45.24%）。

表2 不同质量浓度下细胞存活率Table 2 Survival rate of cells at different concentration

图1 不同处理下NO 的产量Fig. 1 Production of NO under different treatments

2.1.3 TMPE 对TNF-α 和IL-1β 的影响在LPS诱导的RAW264.7 炎症模型中，检测TMPE 对炎性因子TNF-α 和IL-1β 生成的抑制效果， 结果见图2。由图表明，LPS 诱导的模型组中，TNF-α 和IL-1β的质量浓度均显著高于对照组（P＜0.05），加入0.01、0.1、1、10 μg/mL 的TMPE 后均能显著降低TNF-α（抑制率分别是27.91%、36.31%、36.14%、45.09%）和IL-1β 的产生 （抑制率分别是47.75%、58.47%、60.21%、64.55%）（P＜0.05）。 综合细胞活力，NO 生成量实验和本实验结果。 TMPE 的质量浓度在后续的实验中，确定为在10 μg/mL。

图2 不同处理下TNF-α 和IL-1β 的质量浓度Fig. 2 Contents of TNF- alpha and IL-1 beta under different treatments

图3 mRNA 相对表达量Fig. 3 Expression levels of genes

2.1.4 基因表达量检测用10 μg/mL 的TMPE 处理细胞基因mRNA 表达量见图3，与空白组相比较LPS 模型组，相关炎症基因（iNOS、COX-2、NF-κB、STAT3、HIF-1α）的表达量均显著提高（P＜0.05），在LPS+TMPE（10 μg/mL）组中，相关炎症基因的表达量除NF-κB基因外， 其他炎症相关基因（iNOS、COX-2、STAT3、HIF-1α）的表达量与LPS 模型组均显著降低（P＜0.05），iNOS、COX-2 和HIF-1α 基因的表达量仍然显著高于对照组（P＜0.05），其中STAT3的表达量降低程度比对照组的更低， 且差异显著（P＜0.05）。

2.1.5 免疫印迹检测结果用10 μg/mL 的TMPE处理细胞免疫印迹结果见图4， 通过免疫印迹检测TMPE 对炎症相关蛋白质（COX-2，NF-κB，STAT3，HIF-1α） 表达的影响，LPS 模型组与对照组相比炎症相关蛋白质（COX-2、NF-κB、STAT3、HIF-1α）的表达量均有所增加， 其中COX-2 和STAT3 的蛋白质增加量最多，NF-κB 和HIF-1α 蛋白质表达量增加次之。LPS+TMPE 组与LPS 模型组相比，除NF-κB蛋白质变化不明显， 其他蛋白质 （COX-2，STAT3，HIF-1α）的表达量均有降低，特别是STAT3 蛋白质的表达量。在LPS+TMPE 组中STAT3 蛋白质的表达量比对照组都低。

图4 免疫印迹结果Fig. 4 Results of western blot

2.2 讨论

食用菌种类繁多，营养丰富，富含各种氨基酸、脂肪酸、多糖等多种营养成分，口味丰美，同时具有增强免疫力、抗肿瘤、降血糖血脂等药用功能[13-14]。野生蒙古口蘑稀有、绿色、纯天然，倍受大家的追捧。 研究发现，蘑菇多糖提取物具有抗炎等多种药理活性[15]，本实验通过LPS 诱导RAW264.7 细胞的炎症模型， 质量浓度在0.01～10 μg/mL 的TMPE 测试范围内观察到的细胞存活率、NO 生产抑制率及炎性因子TNF-α 和IL-1β 生成的抑制效果随着剂量增加而增加， 质量浓度10 μg/mL 时TMPE 显示出最高的细胞存活率（172%），NO 的最大抑制效果（45.24%），TNF-α 和IL-1β 生成最大的抑制效果（分别为58.47%、65.86%）。 蒙古口蘑多糖提取物有望成为新的抗炎药物。

炎症因子TNF-α 和IL-1β 的产生受转录因子NF-κB 和STAT3 的调控[16]，NO 是由iNOS 和COX-2催化合成的，研究表明甲醇、乙醇提取不同蘑菇的多糖均可以抑制NO 的生成[17-18]，炎症的发生与iNOS和COX-2 的过表达有关[19]，iNOS 和COX-2的表达受转录因子NF-κB、STAT3 及HIF-1α 调控[20]， 抑制JAK2-STATs 活性会导致LPS 诱导的NO 产生及iNOS 的表达[21]，激活HIF-1α 通路会增加NO 的表达[22]。 本实验中选择HIF-1α、NF-κB、STAT3、COX-2、iNOS 作为研究对象， 定量结果显示，TMPE 会导致iNOS、COX-2、STAT3、HIF-1α 的表达量降低，免疫印迹结果显示，TMPE 会导致COX-2、STAT3、HIF-1α 蛋白质的表达量降低， 而NF-κB 的mRNA表达量及蛋白质质量均变化不明显， 因此可以推断TMPE 的抗炎作用主要通过调节转录因子STAT3和HIF-1α 的表达进而调节iNOS 和COX-2 的表达，而不主要通过转录因子NF-κB 的变化发挥抗炎作用，也就是说TMPE 通过JAK-STAT3 及HIF-1α信号通路实现抗炎的效果。

3 结语

通过LPS 诱导RAW264.7 细胞的炎症模型，发现蒙古口蘑多糖提取物在不同浓度下具有不同质量的抗炎活性， 通过对HIF-1α、NF-κB、STAT3、COX-2、iNOS基因及蛋白质的表达确定蒙古口蘑多糖提取物主要通过JAK-STAT3 及HIF-1α 信号通路，而不主要通过NF-κB 信号通路，抑制炎症因子TNF-α、IL-1β 和NO 的释放，进而发挥抗炎作用。