CD24在早期宫颈癌中的作用机制及临床价值探索

孙培松，李博涵，申彦，张雯雯，曲芃芃

宫颈癌发病率在妇女恶性肿瘤中位居第三，绝大多数死亡病例发生于发展中国家。流行病学资料以及实验室研究已经明确高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）持续感染是导致宫颈癌前病变及宫颈癌的必要条件[1]。随着HPV疫苗的应用、检测技术的不断进展及筛查策略的不断成熟，目前宫颈癌的预防成效显著。将HPV检测作为宫颈病变的初筛手段已逐步成为诸多国家宫颈癌筛查的共识。对于持续HR-HPV阳性患者的宫颈病变风险监测逐渐受到人们的重视，发现持续HR-HPV感染进展为癌前病变进而发展为宫颈癌的热点基因意义重大，可以成为早期干预治疗的潜在靶点[2-3]。

本研究通过生物信息学方法，检索并发现正常宫颈组织与宫颈癌组织中差异表达基因指向分化抗原簇蛋白 24（cluster of differentiation 24，CD24），该基因最初被认为是人体内连接糖基化磷脂酰肌醇的B细胞相关抗原，也被用作B细胞和胸腺细胞标志物。随后研究发现CD24在卵巢癌、食道癌、结肠癌、胆管癌、肺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫内膜癌和乳腺癌等多种人类癌症中异常表达，且与患者生存率较低相关[4-5]。但CD24与宫颈癌的关系少有报道，本研究进一步探究CD24与宫颈癌临床病理联系以及与宫颈癌无进展生存期（DFS）及总生存期（OS）的关系，以此来评估CD24作为宫颈病变预测指标的临床价值，并对CD24的作用机制进行初步探索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选用通量癌基因数据库TCGA门户网站GEPIA 数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）以及 UALCAN 数据库（http://UALCAN//ualcan.path.uab.edu/）。

1.2 差异基因筛选 通过TCGA门户网站（http://gepia.cancer-pku.cn/）进行差异基因分析、基因的筛选以及临床预后分析。纳入标准：在早期宫颈癌（Ⅰ期）患者中高表达的基因。排除标准：在阴道宫旁浸润宫颈癌（Ⅱ期）及远处转移性宫颈癌（Ⅲ期+Ⅳ期）患者中的表达高于在早期宫颈癌患者中表达的基因。之后通过差异倍数及P值选取差异性较高的基因，通过文献分析其中可能具有较高临床意义的基因作为目的基因。并通过UALCAN数据库（http://UALCAN//ualcan.path.uab.edu/）进行数据验证。

1.3 免疫组织化学（免疫组化） 病理诊断按世界卫生组织（WHO）标准进行，选取2019年6月—2020年3月天津市中心妇产科医院（我院）就诊的患者中正常宫颈上皮组织、高级别宫颈上皮内病变[HSIL，宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅱ～Ⅲ]组织、ⅠA期宫颈癌组织石蜡切片各5例。患者年龄为43～60岁，正常宫颈上皮组织均来自因子宫腺肌病行子宫全切术的患者。进行CD24免疫组织化学染色：切片脱蜡水化、抗原修复、封闭、滴加一抗[CD24（博奥森 bs-23867R）1∶200 稀释]、滴加二抗、DAB显色。

1.4 蛋白互作关系分析 蛋白互作关系通过string数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）进行分析。交互分数设置为0.4，最大交互因子设定为不超过20个交互因子。并通过GO数据库以及KEGG数据库对交互因子进行富集分析，筛选富集功能及通路。

1.5 核心基因的选择 采用cytoscape中的cytohubba工具，对string数据库的分析结果进行蛋白网络构建并采用计算公式（MCC方法）选出连接点最为集中的前3位核心基因。

1.6 GO以及KEGG富集分析 将string数据库中分子间关联进行GO富集分析，并通过R语言中的GOplot及string软件包结合各分子在宫颈癌及正常人群中的表达差异倍数筛选上调基因及富集通路。

1.7 统计学方法 定量资料的组间比较采用t检验；采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验分析宫颈癌患者CD24表达水平对DFS和OS的影响，P＜0.05为差异有统计学意义。GO以及KEGG富集分析采用矫正后P值，矫正后P＜0.05为富集结果有统计学意义。

2 结果

2.1 差异基因筛选 通过TCGA分析发现正常宫颈组织与宫颈癌组织之间存在2 094个差异基因。根据研究目的对正常组与早期宫颈癌组（Ⅰ期）进行差异基因分析，得到248个差异基因；并分析早期宫颈癌组（Ⅰ期）与阴道宫旁浸润组（Ⅱ期）以及宫颈癌远处转移组（Ⅲ期+Ⅳ期）的差异基因，分别发现346个和468个差异基因，将其与正常组和早期宫颈癌组的差异基因取交集并予以排除。考虑剩余基因主要与早期肿瘤的发生与进展相关，共计剩余53种，再选择出差异倍数＞16倍且P＜0.01的基因。通过进一步查询文献，发现CD24可能具有较高的临床价值，因而将其作为目的基因进行进一步分析。差异基因筛选流程见图1。

图1 差异基因筛选流程图

2.2 数据库验证CD24临床表达 通过对UALCAN数据库中患者信息进行分析，发现差异表达基因CD24在宫颈癌组织（n=298）中的表达水平显著高于正常宫颈组织（n=3，P＜0.01）。根据临床分期对患者进行分组并进行分析发现，CD24在早期宫颈癌（Ⅰ期）组织（n=161）中的表达显著高于正常宫颈组织（n=3，P＜0.05），说明 CD24在宫颈癌早期发生、发展中起一定的作用；CD24在Ⅰ期（n=161）与Ⅱ期宫颈癌患者（n=69）、Ⅰ期（n=161）与Ⅲ期及Ⅳ期（n=68）宫颈癌患者之间的表达水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），且均值略低于早期宫颈癌表达水平，说明CD24可能不是驱动宫颈癌进一步浸润及转移的相关基因。见图2。

将CD24中位数作为阈值，分别将宫颈癌患者分为CD24高表达组及CD24低表达组。通过未加权生存分析发现，2组DFS差异无统计学意义（P=0.49），但CD24高表达组的OS显著低于CD24低表达组，差异有统计学意义（P=0.045），其可能与患者的预后存在关联。见图3（见后插二）。

2.3 HSIL与早期宫颈癌中CD24表达差异分析 对我院收集的宫颈正常者、HSIL患者以及早期宫颈癌患者的宫颈组织进行免疫组化分析，观察3组CD24表达的差异。棕色为免疫组化染色阳性，结果发现CD24在HSIL以及早期宫颈癌患者中表达逐渐增加，在早期宫颈癌患者的表达呈强阳性，而在HSIL与正常宫颈组织分别为弱阳性及阴性。见图4（见后插二）。

2.4 CD24对于早期宫颈癌发生、发展的机制探索 通过string数据库对CD24进行蛋白网络互作分析发现各分子互作关系网见图5（见后插二）。通过cytoscape对蛋白互作网络进行进一步分析，从而对其中起主要调控作用的核心基因进行筛选，共筛选出3个核心基因，其节点关联性排名依次为CD24、CD44以及TP53，见图6（见后插二）。

进一步的CD24及其相关核心基因对应蛋白的GO富集分析结果包括生物过程（GO-BP）、分子功能（GO-MF）、细胞成分（GO-CC），见表1。其中GO-BP主要富集于信号转导正调控以及细胞间信号转导正调控，两者均与激活或增加细胞内信号传导的频率、速率或程度的生物过程相关；GO-MF提示其主要功能与蛋白结合以及酶结合结构相关；GO-CC分析提示CD24基因对应蛋白主要位于细胞表面以及脂膜外侧。根据基因表达差异分析其对应蛋白功能均为正调控，见图7（见封三）。

图2 CD24表达差异数据库验证

进一步对CD24基因进行KEGG通路分析，结果提示其与癌症发展的信号通路密切相关：包括癌症通路以及癌症的微小RNA（microRNAs）通路，之后在磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路发生富集（矫正后P＜0.05）。根据KEGG注释该通路由生长因子与其受体酪氨酸激酶结合后激活调节细胞转录、翻译、增殖等功能，同时也是肿瘤增殖生长的重要通路之一。见图8（见封三）。

表1 CD24及其相关基因对应蛋白的GO富集分析结果

图3 CD24表达在宫颈癌患者中的生存曲线分析

图4 CD24在正常宫颈组织、HSIL以及早期宫颈癌组织中的表达（免疫组化×100）

图5 CD24蛋白互作网络图

图6 CD24及其相关核心基因作用网络图

图7 CD24及其相关基因对应蛋白GO功能富集分析

图8 CD24及其相关蛋白KEGG通路分析

3 讨论

近年来，精准医学概念对医学产生了巨大影响，尤其在肿瘤领域。针对宫颈癌同样有许多相关的生物信息技术分析，由于公共数据库的局限以及目前的关注热点，大多数的数据挖掘分析集中于潜在的治疗靶点以及影响宫颈癌预后的指标[6]，较少有生物信息研究集中于早期宫颈癌的发生、发展以及宫颈病变预测指标。

CD24又称热稳定抗原，是一种高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇锚定表面蛋白，已知与先天免疫细胞上的 SIGLEC10（sialic-acid-binding Ig-like lectin 10）相互作用，抑制响应感染、败血症、肝损伤和慢性移植物抗宿主疾病的破坏性炎症反应[7-8]。然而，也有研究显示CD24表达于多种实体肿瘤，但该分子在调节肿瘤免疫反应中的作用尚未被证实[9-10]。

本研究通过设计筛选流程，分析正常组与早期宫颈癌组（Ⅰ期）之间的差异基因，并分析早期宫颈癌组（Ⅰ期）与阴道宫旁浸润组（Ⅱ期）以及宫颈癌远处转移组（Ⅲ期+Ⅳ期）的差异基因，予以排除。从临床病理角度筛选出可能与宫颈癌变发生、发展相关并可能作为宫颈病变预测指标的基因——CD24。通过其他数据库验证该基因表达变化主要发生于宫颈癌早期。随后，研究通过免疫组化分析正常、HSIL以及早期宫颈癌患者宫颈组织CD24的表达差异，结果与数据发掘的假设结果相符，即正常宫颈组织的CD24表达较低，而在宫颈病变及早期宫颈癌中表达逐渐上升，考虑其可能作为临床预测宫颈病变进展的潜在指标。为了进一步寻找依据，本研究通过公共数据库对CD24的可能作用机制进行了进一步的分析挖掘。通过string数据库分析以及核心基因的计算，发现CD24的功能与CD44以及TP53基因密切相关。根据NCBI基因数据库注释，CD44主要与细胞间黏附力相关，而TP53则是宫颈癌发生、发展中极为重要的因子之一。为了进一步探究CD24基因的功能，本研究进行了GO富集分析，其主要富集于信号通路正调控，通过GO注释以及文献查阅发现，许多肿瘤通路相关基因，包括表皮生长因子通路以及PI3K-Akt信号通路相关基因均有许多富集于此功能区，该功能与肿瘤的发生、发展密切相关。最后，研究进行了KEGG信号通路富集分析，富集结果与GO富集分析结果相互印证。考虑CD24可能通过PI3K-Akt信号通路影响宫颈癌的发生、发展[11-12]。

目前，在宫颈癌的研究中发现CD24往往与CD44共同表达，可作为宫颈肿瘤干细胞的标记蛋白之一[5,13]。与成熟的宫颈细胞相比，CD24高表达的宫颈癌细胞往往同时表达低分化细胞的标志性蛋白波形蛋白以及oct4，提示CD24可能与宫颈细胞的去分化过程存在一定的相关性[4]。研究发现，CD24高表达的SiHa细胞增殖速度增加，且抗凋亡能力更强，与本研究分析的结果相符。同时，部分研究发现CD24高表达可能增加宫颈癌细胞抗照射能力，使肿瘤对放疗的敏感度降低，从而影响宫颈癌患者的治疗效果及预后[5,14]。

本研究通过TCGA数据库门户分析出对于早期宫颈癌发生、发展较为重要的基因CD24，并通过免疫组化首次验证了CD24在HSIL以及早期宫颈癌中的表达水平升高，为临床宫颈病变风险预测提供新的可能指标。但是本研究为初部探索性研究，纳入的病例较少，因而无法进一步进行统计学分析，在之后的研究中将进一步增加样本量，同时对纳入患者展开前瞻性研究，探讨CD24表达对患者的长期影响。

综上所述，考虑CD24在早期宫颈癌的发生、发展中发挥重要作用，其可通过增加肿瘤细胞的增殖能力促进肿瘤的发展。同时，由于CD24在宫颈病变以及癌组织中的差异表达，其可能具有宫颈病变风险预测的临床意义。随后课题组将针对CD24进行进一步的研究以及临床随访，探究CD24在宫颈病变临床预测中的临床价值。