长链非编码RNA CCAT1在妇科肿瘤中的研究进展

郭学旺，徐燕颖

人类基因组测序结果显示，70%的基因组可以转录成RNA，然而仅有2%的基因组可以最终翻译成蛋白质，由此可见基因组中包含大量的非编码RNA，包括微小 RNA（microRNA，miRNA）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNAs）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等[1]。在对基因组的早期研究中，蛋白编码基因长期居于至关重要的地位，而如今越来越多的研究发现lncRNA、miRNA等非编码RNA在肿瘤发生、发展过程中发挥关键的调节作用[2-3]。这些非编码RNA几乎在所有肿瘤形成过程中通过调节肿瘤微环境发挥功能[4]。在非编码RNA中，lncRNA作为一种主要发挥调节作用的核苷酸序列，在近几年成为恶性肿瘤研究领域的热点。近来，学者发现lncRNA结肠癌相关转录因子 1（colon cancer associated transcript 1，CCAT1）在女性生殖系统恶性肿瘤中的异常表达对疾病的诊断和预后具有重要的研究意义。关于lncRNA CCAT1在妇科恶性肿瘤中的表达水平及作用机制的研究有待为妇科恶性肿瘤的诊断及治疗提供新的指标以及治疗靶点。本文就CCAT1的生物学特性及其在三大常见妇科恶性肿瘤中的作用进行阐述。

1 lncRNA CCAT1

lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA序列，没有开放阅读框，其本身无法翻译成蛋白质，只能参与转录过程的调控[5]。越来越多的证据表明，lncRNA在诸多细胞生命过程（细胞周期、分化、凋亡、转移及肿瘤发生等）中通过转录调控、蛋白质修饰、RNA-蛋白或蛋白-蛋白复合物的形成等途径在细胞编程的调控中发挥重要作用[6]。此外Engreitz等[7]还证实lncRNA发挥功能并不局限于其基因座，还通过基因串扰对编码基因及其他非编码基因进行调控。另有研究表明，miRNA与mRNA上的miRNA应答元件结合可引起mRNA翻译抑制或降解，当lncRNA与这个mRNA存在相同的miRNA应答元件时，它们之间即构成了竞争结合miRNA的作用关系，称之为内源竞争 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），miRNA 则在其中发挥重要的关联节点作用[8-9]。Zhou等[10]通过构建卵巢癌lncRNA相关ceRNA网络，对lncRNA的作用机制进行报道，使得lncRNA的ceRNA机制成为lncRNA的研究热点。lncRNA在上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）中调控作用的发现，也为lncRNA在恶性肿瘤中调控作用的研究奠定了基础[11]。

CCAT1属于lncRNA，定位在染色体8q24.21上，由2 628个核苷酸组成。自2012年在结肠癌中的异常表达被发现以来[12]，CCAT1在多种恶性肿瘤中的重要作用引起人们越来越多的关注。He等[13]通过定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）验证了CCAT1在结肠癌标本中高表达，并发现CCAT1的表达水平与结肠癌的病理分级、淋巴结转移存在相关性；根据标本组织中的CCAT1表达水平将48例结肠癌患者分为高CCAT1组和低CCAT1组，随访发现高CCAT1组患者生存期明显短于低CCAT1组。随后该研究通过生物信息学分析预测了可能与CCAT1存在潜在结合位点的转录因子c-myc，并通过染色质免疫沉淀证实c-myc与CCAT1启动子区域的直接结合关系。为了进一步验证CCAT1对细胞功能的影响，该研究将转染CCAT1的环状DNA质粒（pcDNA-CCAT1）转染SW480和SW620细胞株后，通过细胞功能试验发现CCAT1对细胞的生长、增殖和侵袭能力具有促进作用。Abedini等[14]通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测出CCAT1在结肠癌患者及健康者的外周循环中差异表达，为CCAT1作为简单、可行的结肠癌诊断指标提供了可能。Zhang等[15]研究发现，CCAT1通过ceRNA机制引起miR-7水平下调，进而使同源异形盒基因B13（homeobox B13，HOXB13）水平升高，并且可以作为两种表观遗传修饰复合物（PRC2、SUV39H1）的支架，调节SPRY4启动子基因组甲基化，促进食管鳞状细胞癌的发生和发展。Chen等[16]研究发现，CCAT1通过ceRNA机制参与抑制miR-181a-5p，引起同源异形盒基因A1（HOXA1）表达升高，促进多发性骨髓瘤的进展。Chen等[17]报道，CCAT1与miRNA let-7c相互作用引起let-7c靶标B细胞淋巴瘤/白血病-xL（B cell lymphoma/leukemia-xL，Bcl-xL）的释放，促进肺腺癌细胞耐药性的获得以及EMT。

2 CCAT1与宫颈癌

Jia等[18]首先通过qRT-PCR发现CCAT1在宫颈癌组织中较癌旁正常组织表达增高，并且表达水平与肿瘤体积呈正相关，与生存期、预后呈负相关。随后基于Hela细胞通过MTT法及克隆形成试验证实CCAT1对细胞生存、增殖具有促进作用，通过Transwell实验发现CCAT1的表达水平与Hela细胞的侵袭能力呈正相关。Shen等[19]对CCAT1在宫颈癌细胞中的作用机制做了进一步探索，通过qRT-PCR发现CCAT1在宫颈鳞癌及宫颈腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，在宫颈癌细胞株（Hela、HEK293、SiHa）中的表达水平也明显升高，尤其在HEK293细胞株中表达最高。实验以SiHa和HeLa细胞株作为研究对象，通过细胞功能试验证实转染了lv-CCAT1的细胞株的生长、增殖及侵袭能力显著高于空白对照组。为了进一步研究CCAT1的作用机制，研究通过starBase v.2.0筛选出可能与CCAT1相互作用的miRNA——miR-181a-5p，并应用qRT-PCR检测出miR-181a-5p在CCAT1过表达的SiHa和Hela细胞中表达显著减低，同时伴有基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase 14，MMP14）mRNA 表达水平、MMP14蛋白活性、肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）表达水平显著升高。为了证实CCAT1、miR-181a-5p、MMP14的上下游作用关系，该研究将miR-181a-5p mimic转染到CCAT1过表达的SiHa和Hela细胞中，发现miR-181a-5p的过表达逆转了CCAT1对宫颈癌细胞增殖能力的促进作用，当同时转染lvshCCAT1和miR-181a-5p inhibitor时，细胞的增殖能力又得以增强。而CCAT1的表达水平并未因为转染了miR-181a-5p mimic或者miR-181a-5p inhibitor而发生改变，MMP14、HB-EGF mRNA 和蛋白表达量在miR-181a-5p mimic组降低，在miR-181a-5p inhibitor组升高，提示CCAT1通过miR-181a-5p/MMP14轴发挥作用。Zhang等[20]研究发现，MMP14水平的下调可抑制Hela细胞的增殖能力，同时减少转化生长因子A1和血管内皮细胞生长因子B的表达，这也进一步证实了CCAT1/miR-181a-5p/MMP14轴与宫颈癌之间的相关性。Shen等[19]在进一步的研究中将转染CCAT1的SiHa和HeLa细胞注入小鼠皮下，观察到转染后的细胞相对于对照组生长更快，并且通过免疫组织化学技术在体内水平证实MMP14和HB-EGF的表达水平在CCAT1过表达的宫颈癌细胞中升高，再次验证了CCAT1通过MMP14和HB-EGF对细胞功能发挥调控作用。

3 CCAT1与子宫内膜癌

Yu等[21]研究发现CCAT1在子宫内膜癌中也发挥着促瘤形成和发展作用，通过qRT-PCR发现CCAT1在子宫内膜癌组织中较癌旁正常组织表达明显升高，并且在子宫内膜癌细胞系（HEC-1-A、KLE和Ishikawa）中较正常子宫内膜细胞系（T-HESC）表达明显上调，同时发现miR-181a-5p在子宫内膜癌组织及细胞系中表达明显低于癌旁正常组织及正常子宫内膜细胞系，推测CCAT1可能调节子宫内膜癌中miR-181a-5p的表达水平。为了对CCAT1与miR-181a-5p之间的关系进行验证，研究通过starBase（starbase.sysu.edu.cn） 证明了 CCAT1与miR-181a-5p之间存在潜在的结合位点，并通过双荧光素酶报告实验加以验证。调低CCAT1后miR-181a-5p表达增高，而miR-181a-5p过表达后CCAT1的表达水平明显减低，提示CCAT1与miR-181a-5p之间存在负性调节关系。随后，通过细胞功能试验证实抑制CCAT1表达后KLE细胞株增殖能力降低、侵袭能力减弱；而miR-181a-5p过表达亦使细胞增殖能力明显降低。同时抑制miR-181a-5p和CCAT1表达发现，抑制miR-181a-5p表达逆转了敲低CCAT1对细胞增殖能力的负调控作用。Korhan等[22]发现下调miR-181a-5p可以使c-MET表达升高进而发挥促癌作用。Yu等[21]通过蛋白质印迹法（Western blotting）在miR-181a-5p过表达的KLE细胞株中检测到c-MET表达受到抑制，在CCAT1敲低的KLE细胞株中c-MET表达减少，提示CCAT1/miR-181a-5p轴在子宫内膜癌中发挥调控作用。虽然目前关于CCAT1在子宫内膜癌中研究相对较少，但可以发现CCAT1在子宫内膜癌中同样发挥一定的促癌作用，并与miRNA通过内源竞争的形式发挥调节功能。

4 CCAT1与卵巢癌

Cao等[23]首先通过qRT-PCR发现卵巢癌组织中CCAT1的表达水平显著高于癌旁正常组织。以癌组织CCAT1中位表达水平为界点将72例癌组织分为高表达组和低表达组，发现2组国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、组织学分级以及是否存在淋巴结转移存在明显差异，而2组年龄、组织学类型、是否有腹水差异无统计学意义。而且发现CCAT1表达水平高者生存期更短。CCAT1的表达水平在人卵巢癌细胞株比人正常卵巢上皮细胞明显升高，并且在卵巢癌转移细胞系HO8910PM中的表达水平明显高于亲本细胞系HO8910，由此考虑CCAT1可能与细胞的转移特性相关。为了证实猜想，该研究将si-CCAT1转染HO8910PM细胞株并通过qRT-PCR验证转染效果后，通过Western blotting检测出E-钙黏蛋白表达升高以及波形蛋白、N-钙黏蛋白表达降低，并且在癌组织以及癌旁正常组织中检测EMT相关蛋白表达水平时也得出相同的结果。随后通过细胞功能试验发现过表达CCAT1对HO8910PM细胞株的迁移能力、侵袭能力具有增强作用。Cao等[23]还利用starBase v2.0筛选出可能与CCAT1存在潜在结合位点的miR-152和miR-130b，并通过双荧光素酶报告试验对其结合关系加以验证，同时通过qRT-PCR检测到CCAT1在卵巢癌细胞株中的表达水平明显高于正常卵巢细胞株。为了验证CCAT1与miR-152和miR-130b之间的作用关系，以HO8910PM作为实验对象，在过表达CCAT1之后检测出miR-152和miR-130b表达水平降低。由此推测，CCAT1直接靶向作用于miR-152和miR-130b并发挥负调控作用。上调miR-152和miR-130b的表达之后通过Western blotting检测出E-钙黏蛋白表达升高，波形蛋白、N-钙黏蛋白表达降低，也进一步验证了以上结论。该研究进一步通过Target Scan软件预测并利用Western blotting验证了卵巢癌组织中ADAM17、Wnt1、STAT3和ZEB1的表达水平明显上调，并发现miR-152与ADAM17、Wnt1 mRNA及蛋白表达水平呈负相关，miR-130b与STAT3、ZEB1的mRNA及蛋白水平呈负相关，双荧光素酶报告实验也验证了其直接作用关系。由此推测CCAT1通过CCAT1-miR-152/miR-130b/ADAM17/Wnt1/STAT1/ZEB1轴在卵巢癌的发生中发挥重要调节作用。Lai等[24]通过qRT-PCR在40例卵巢癌组织标本以及卵巢癌细胞株中同样发现CCAT1表达水平显著升高，并发现CCAT1表达水平与肿瘤体积、淋巴结转移呈正相关，与生存期呈负相关。下调CCAT1表达后，OVCAR-8和SKOV-3卵巢癌细胞株的增殖、转移能力明显受到抑制。Lai等[24]通过生物信息学分析筛选出可能与CCAT1发生直接作用的miR-1290，发现CCAT1表达被抑制时，miR-1290的表达水平显著升高；而下调miR-1290的表达后，CCAT1对细胞增殖能力的促进作用得以恢复，证实CCAT1通过miR-1290发挥对细胞增殖能力的促进作用。Mu等[25]基于CCAT1在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中的高表达，进行了更深入的研究。研究将SKOV3和CaOV3细胞株以10 ng/mL转化生长因子 β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）处理48 h后，通过qRT-PCR技术检测出CCAT1表达水平升高，并且抑制CCAT1表达后，TGFβ1诱导波形蛋白、N-钙黏蛋白、MMP9的表达水平显著降低，而E-钙黏蛋白及Claudin蛋白表达水平显著升高。为了探讨下调CCAT1抑制TGFβ1诱导EMT的机制，该研究在下调CCAT1表达后发现TGFβ受体1（TGFβR1）的mRNA及蛋白水平均明显降低，推测CCAT1通过减少TGFβR1的表达间接抑制EMT。Chen等[26]研究发现miR-490-3p对卵巢癌的发生和发展存在抑制作用。鉴于此，Mu等[25]推测CCAT1与miR-490-3p可能存在一定的相互调节关系，并通过双荧光素酶活性试验验证了这种相互作用关系。在对miR-490-3p下游分子的研究中，证实miR-490-3p与 TGFβR1 mRNA 的 3′非翻译区（3′untranslated region，3′UTR）存在直接结合关系，过表达miR-490-3p后检测到TGFβR1的表达水平降低；同时转染miR-490-3p和TGFβR1后，miR-490-3p对细胞EMT的抑制作用被逆转，细胞侵袭能力增强。由此推测，在卵巢癌中CCAT1对miR-490-3p具有负调控作用，并且通过CCAT1/miR-490-3p/TGFβR1对EMT发挥调控作用。

5 结语

综上所述，自CCAT1在结直肠癌中被发现以来，其通过多系统对恶性肿瘤的调节作用陆续被发现。在已报道的妇科三大恶性肿瘤中，CCAT1的表达水平均升高，并且CCAT1的表达水平与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移能力呈正相关，与患者的生存期和预后呈负相关。以波形蛋白、N-钙黏蛋白、MMP9、E-钙黏蛋白、Claudin蛋白表达异常为代表的EMT也因为CCAT1的高表达而发生相应变化，提示CCAT1高表达对EMT具有促进作用，这也证实了其在肿瘤发生过程中的重要地位。目前关于CCAT1的研究仍局限于lncRNA与miRNA之间的ceRNA机制所发挥的调节作用。在CCAT1表达增高的恶性肿瘤中，存在内源性竞争作用的miRNA表达相应降低，在CCAT1与既往研究确认的miRNA相关通路之间搭建了联系的桥梁，使CCAT1成为肿瘤调节分子网络的重要新成员（见图1）。CCAT1其他作用机制（如表观遗传调控、转录调控、转录后调控等）仍需大量研究证实，并对其应用于临床诊断和治疗的潜能进行充分挖掘。目前CCAT1在妇科恶性肿瘤中的研究相对较少，其上下游作用分子的研究及调控网络尚不十分明确，仍需对其作用机制及信号通路进行详细研究，为恶性肿瘤分子水平的治疗提供有效的作用靶点。目前关于CCAT1表达水平的检测过程较为繁琐且价格高昂，真正做到临床应用仍需进一步研究其在不同组织中表达水平的相关性，并通过统计学对大量临床样本进行特异度、敏感度研究，以提高其作为诊断标志物的价值。

图1 CCAT1在宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌的分子调控网络