ICR鼠肝和肾毒性损伤生物标志物的筛选

戴铭睿,索良东,康潍循,郭丽颖,高 歆,曹英琪,黄兴宇,王志强,冯程宇,曲 静,贺小英*

(1.内蒙古科技大学生命科学与技术学院,内蒙古包头 014010;2.赤峰市医院耳鼻喉科,内蒙古赤峰 024000)

动物毒理损伤是指外源因素包括化学、物理和生物因素等对动物机体的损害,肝脏与肾脏是哺乳动物对外界有害物响应的重要器官。当今,寻找科学有效的手段用于评价动物毒理损伤是生物学和医学领域一直以来研究的热点。通常,国际上采用理化分析方法,该方法具有准确、灵敏和快速的特点,在动物毒理损伤的研究过程中起着重要作用。然而,理化分析存在动态不稳定,不太适合动物毒理或病理学的诊断的缺点[1]。近年来,利用分子标志物对动物毒理学和病理学的研究成为了关注的焦点。此外,ICR小鼠因为与人的基因具有较高的同源性因此可作为用来对人类毒理学及病理学进行评估较为理想的模式生物。通过前期的调查发现受污染的地下水会对ICR小鼠的肝脏和肾脏功能造成遗传性损伤[2]。因此,为了进行筛选针对肝、肾损伤的分子标志物,本试验构建了ICR小鼠毒性损伤的病理学模型,并对小鼠肝脏、肾脏样本进行高通量测序,筛选出显著上调基因,绘制基因功能交叉分类韦恩图,根据基因功能分类及基因信号通路富集筛选可作为分子标志物的基因,并在细胞水平上观察其形态损伤影响和分子标记基因进行验证。本研究旨在为有毒有害物对于生物体肝、肾损伤的诊断和健康评价提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4周龄ICR雌性小鼠,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,饲养于内蒙古科技大学动物实验室,通风良好,温度20～25℃,湿度50%～60%,自由采食。本试验动物来源及使用操作均严格遵循动物伦理要求。

1.1.2 主要试剂 75%乙醇,天津市风船化学试剂科技有限公司产品;0.9%生理盐水,山东齐都药业有限公司产品;硝酸,北京化学试剂厂产品。

1.1.3 仪器设备 二氧化碳培养箱(Galaxy S 型) RS Biotech公司产品;荧光倒置显微镜(AE30/31+型),日本尼康株式会社产品;水浴锅(Thermo Scientific 型),莱恩德智能科技有限公司产品;分析天平(MP6001型),上海精密科学仪器有限公司产品;Real-time PCR仪(Thermo Scientific 型),英潍捷基上海贸易有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠毒性损伤模型制备 本研究采用的水样点为北方某地矿区及尾矿库,且该地区已被证实水质受污染[2-3]。根据矿区水样的位置不同,将小鼠分为L1～L5共5个组进行建模,将尾矿库取样水作用的小鼠分为2组,分别为渗漏水喂养的S组和库内水喂养的K组,同时设置对照组采用自来水喂养,保持8个组小鼠饲喂条件相同,适应性培养7 d后进行每日定时进行灌胃,每只鼠每次0.2 mL,28 d为1个周期。

1.2.2 采取ICR小鼠肝脏和肾脏 试剂、容器、器械提前4℃预冷,用颈椎脱臼法处死小鼠后用75%乙醇对小鼠皮毛进行表面消毒,使用剪毛剪打开小鼠腹腔后换用新的镊子和剪刀小心取出肝脏及肾脏,避免污染,使用生理盐水冲洗血渍将脏器置于一次性无菌培养皿中,保存4℃用于后续研究。

1.2.3 高通量测序 所需基因文库构建结束后,使用PCR扩增技术对基因文库片段进行富集,根据片段大小进行文库选择,控制文库大小在450 bp。进行质检后,对文库总浓度及有效浓度进行检测,然后将文库进行混合。

样品经过RNA抽提、纯化、建库之后,采用二代测序技术(NGS),基于Illumina测序平台,对这些文库进行双末端(paired-end,PE)测序。

2 结果

2.1 对肝脏的高通量的测序分析

小鼠经北方某矿区渗漏水28 d灌胃后处死,采取其肝脏组织提取总RNA进行高通量测序,将得到的数据进行分类整理,筛选出pval<0.001的基因进行进一步分析得到基因表达差异火山图(图1)。

横纵坐标分别表示试验组(Case)和对照组(ctrl)生物学重复差异倍数FC值的对数值。根据基因表达差异倍数FC值的筛选,红色圆点表示显著的上调基因,绿色圆点表示显著下调的基因,灰色圆点表示差异不显著的基因。

L1与ctrl中差异基因共14个,其中呈现上调的差异基因共9个,呈现下调的基因有5个。L1与L5中下调较为显著差异基因有20个,上调显著差异基因35个。L5与ctrl下调显著差异基因有40个,上调显著差异基因有22个。

通过得到的数据可知,经过矿区不同位置水样灌胃的小鼠其肝脏器官部分基因表达出现了差异,现对其差异基因进行Venn图处理(图片未显示)。以a1为L1组和ctrl的差异基因,b1为L5组与ctrl的差异基因,c1为L1组和L5组的差异基因,d1为L3和L5组的差异基因。其中a1与b1两组相同差异基因有4个,a1与c1两组相同差异基因有4个,b1与c1与两组相同差异基因有23个,b1组、c1组和d1组3组相同差异基因有2个。

2.2 对肾脏的高通量的测序分析

通过高通量测序了解到了矿区水样对小鼠肾脏的基因表达影响情况火山图如下。

矿区L1取样点样水与内蒙古科技大学自来水对小鼠进行灌胃28 d,后小鼠肾脏器官出现的基因表达差异如图2所示。其中下调显著差异基因有19个,上调显著差异基因有11个。L1取样点样水与L5取样点水对小鼠其中下调显著差异基因有9个,上调显著差异基因有16个。L3与ctrl其中下调显著差异基因有9个,上调显著差异基因有16个。L3与L5 出现的基因表达差异中下调显著差异基因有2个,上调显著差异基因3个。L5组与ctrl中下调显著差异基因有11个,上调显著差异基因有1个。

A.L1与ctrl ;B.L1与L5; C.L3与ctrl; D.L3与L5; E.L5与ctrl

对差异基因进行进一步分析,将所得部分差异基因进行韦恩图绘制。

a2集合为L1组与对照组的差异基因,b2集合为L3与对照组的差异基因,c2集合为Y5与对照组的差异基因,d2组为L3与L5的差异基因,e2组为L1与L5的差异基因。其中a2与b2相同差异基因有2个,a2与c2两交集有1个差异基因,a2与e2相同差异基因有5个,b2与c2相同差异基因有1个,b2与d2相同差异基因有1个,c2与d2相同差异基因有1个,c2与e2相同差异基因有12个,a2集合b2集合与e2集合相同差异基因有1个,a2集合b2集合d2集合与e2集合相同差异基因有1个。

2.3 某尾矿库水对生物体的影响

2.3.1 对肝脏的高通量的测序分析 使用库内水与内蒙古科技大学自来水对小鼠灌胃28d后小鼠肝脏器官出现的基因表达差异如图3所示。

A.库内水组与ctrl; B.库内水组与渗漏水组; C.渗漏水组与ctrl

其中下调显著差异基因有36个,上调显著差异基因有55个。库内水组与渗漏水组差异基因中下调显著差异基因有31个,上调显著差异基因有18个。渗漏水与对照组差异基因中下调显著差异基因有90个,上调显著差异基因有102个。

筛选数据绘制肝脏差异基因韦恩图,a3为库内水与ctrl差异基因,b3组为渗漏水与ctrl部分差异基因,c3组为渗漏水与库内水的部分差异基因。其中a3组与b3组相同差异基因有16个,b3组与c3组差异基因有15个。

2.3.2 对肾脏的高通量的测序分析 分别取得库内水以及渗漏水对小鼠灌胃28 d后对小鼠肾脏器官样本进行高通量测序分析,分析结果如下。

其中下调显著差异基因32个,上调显著差异基因52个。库内水与渗漏水组间下调显著差异基因23个,上调显著差异基因12个。库内水与自来水对照组间下调显著差异基因9个,上调显著差异基因21个。

筛选处理数据后绘制部分肾脏差异基因韦恩图处理后得(图4)。a4组为库内水与对照组差异基因,b4组为渗漏水与对照组部分差异基因,c4组为渗漏水与库内水部分差异基因。a4组与b4组相同差异基因有27个,b4组与c4组差异基因有47个,a4,b4,c4 3个组相同差异基因共3个。

A.渗漏水组与ctrl; B.库内水组与渗漏水组; C.库内水组与ctrl

2.4 受污染水源对肝脏与肾脏的影响

通过以上试验数据分析整理,我们可得知不同矿区水源,不同水源位置,对小鼠肝脏以及肾脏造成不同影响。在各个小组对比中我们可以看出,来源不同矿区水样对小鼠灌胃处理后小鼠的肾脏肝脏影响导致不同差异表达基因。如果想要进一步发掘环境污染早期筛选及生态风险评价分子标志物,我们需要进一步缩小差异基因范围。本试验对不同水源地肝脏和肾脏器官差异表达基因进行进一步分析。

a5代表尾矿库样水对小鼠肝脏器官影响下差异表达基因,b5代表北方某矿区样水对小鼠肝脏器官产生的差异表达基因,其中两集合交集基因共23个,每个基因在本试验每个小鼠体内都有相同的调控方向。a6代表矿区样水对小鼠肾脏器官差异表达基因,b6代表尾矿库样水对小鼠肾脏器官差异表达基因,其中两集合交集基因共25个,且每个基因在本试验的每个小鼠体内都具有相同的调控方向。

2.5 体外培养细胞系毒理学形态观察

使用具有主要影响作用的重金属离子与盐离子摸索最适损伤浓度对体外培养的NRK细胞进行胁迫作用,其Mn2+浓度为900 μmol/mL、Zn+浓度为570 μmol/mL、F-浓度为15 mmol/mL、Cl-浓度为150 mmol/mL对细胞形态以及数量具有显著影响。

3 讨论

生物体可以通过不同的途径接触到有毒有害物造成不同程度的肝肾损伤,比如饮用受污染的水、呼吸道传播、给药等。经调查发现,在内蒙古东部某医院2013年至今,凡从事矿区或冶炼工作的人群,通过耳鼻喉长期接触污染源,最终会合并严重肝肾损伤病例(数据未显示)。因此,寻找有毒有害污染的分子标志物对动物乃至人类肝肾疾病的诊断治疗具有重要意义。

本试验通过研究小鼠肝脏和肾脏基因表达差异现象,并对不同水样灌胃小鼠肝脏和肾脏差异表达基因数据进行筛选分析。得到了不同组别中相同差异表达基因。这些基因对发现和探寻环境污染早期诊断以及生态风险评估分子标志物提供了理论基础。通过分析北方某矿区与尾矿库样水对小鼠肝脏基因的差异表达数据得到了显著差异基因23个以及肾脏显著差异基因25个。针对这些显著差异基因进行检索查阅,这些基因按功能分类如表1所示。

表1 差异基因功能分类表

这些基因主要富集在小鼠的免疫、基因表达调控、代谢、癌变、凋亡等方面有主要影响。其中Chordc1基因与Cry1基因在两个矿区小鼠肝脏和肾脏差异表达基因中均有高表达出现,因此可以初步推断Chordc1基因与Cry1基因具有作为分子标志物的研究价值,其中Chordc1基因可调节中心体复制,也可以抑制ROCK2的激酶活性,对肌动蛋白细胞骨架重塑也有一定的调控作用,同时参与了哺乳动物大脑的昼夜节律与稳态机制[3]。Cry1基因可参与构成生物钟核心成分的转录抑制因子,在肝脏中对维持全身葡萄糖稳态至关重要[4]。该基因可通过与膜偶联G蛋白结合并阻断胰高血糖素介导的细胞内cAMP浓度增加和CREB1磷酸化,介导cAMP信号传导和糖异生的昼夜节律调节[5]。也可以通过降低下调糖异生基因表达的核FoxO1水平来抑制肝糖异生[6]。在调节细胞周期和代谢方面有一定的作用[7]。

分子标志物在医疗诊断、动物毒理及环境污染等领域的贡献已经逐渐显现出来,更为准确、快速、高效的分子标志物将逐渐被各个领域发现并应用。本试验所得的小鼠体内Chordc1基因与Cry1基因对于尾矿地区环境污染诊断问题有较重要的实际意义,可以通过对Chordc1基因在免疫系统中所参与的调控方式进行研究[8],探明小鼠体内出现的较为显著的生理指标,建立与环境污染程度匹配的参考体系,从而准确快速灵敏的做到环境污染早期检测与生态风险评估功能。对于Cry1基因注重其代谢方向产生影响,现有研究表明其与重度抑郁症,失眠和焦虑[9],昼夜节律有较为密切的关联[10]。可以针对Chordc1基因与Cry1基因展开更为深层次研究,例如通过对Chordc1基因与Cry1基因的表达过程,下游分子通路探究及功能回复验证进行研究,可进一步提高该基因的分子标志物准确性。对该基因进行Spring分析,筛选下游潜在靶标互作分子,采用敲低质粒敲低该基因,qPCR检测靶标分子表达量判断是否与其GEO数据库的生物信息学分析变化趋势一致,可选取变化最显著的靶标分子作为研究目标进一步探寻与蛋白的互作模式。