DNA损伤应答通路抑制剂治疗卵巢癌的研究进展

王柯若，李慧锴，秦宇

卵巢癌由于典型症状和体征出现较晚，而且缺乏有效的筛查手段和早期诊断方法，5年生存率低于45%，目前的主要治疗策略为减瘤术联合铂类等化学疗法，但是其复发率较高且预后不良[1]。与其他恶性肿瘤类似，卵巢癌的病理生理学受到广泛研究，并且 DNA 损伤应答（DNA damage response，DDR）通路相关蛋白激酶的畸变对肿瘤的形成及发展起到重要作用，因而针对DDR途径设计的抑制剂为卵巢癌的靶向治疗提供了新思路[2]。

在细胞增殖和分化过程中，胞内DNA会受到各种内源性、外源性刺激作用而受损，如碱基损伤、单链断裂（single-strand break，SSB）、双链断裂（doublestrand break，DSB）等[3]。目前引起DNA损伤主要包括两种途径，一是正常代谢过程障碍导致的内源性损伤，如产生副产物活性氧簇、复制错误等；二是外界环境刺激作用引起的外源性损伤，如电离辐射、化学药物等。未修复的DNA损伤会导致细胞染色体数量和结构产生变化诱导细胞凋亡，同时DNA损伤也会破坏基因组稳定性从而影响其编码、转录能力[3]。基因组稳定性对于基因组的正常复制至关重要，为了减少DNA损伤对细胞的危害，细胞已经进化出多种机制进行DDR，包括碱基切除修复（base excision repair，BER）、错配修复（mismatch repair，MMR）、非同源末端连接（non-homologous end recombination，NHEJ）和同源重组（homologous recombination，HR）等[4]。肿瘤细胞通常伴有DDR途径缺陷，DDR缺陷会导致基因组不稳定性，从而通过积累突变成为导致癌症发生、发展的重要因素之一。目前，已经研发了多种利用DDR通路缺陷来治疗癌症的药物，开发此类靶向DDR抑制剂的前提是此类药物能导致DNA损伤，并靶向肿瘤细胞特征性改变[5]。本文主要对DDR途径有代表性的激酶抑制剂的作用机制及治疗卵巢癌的研究进展进行综述，并对其应用前景加以讨论。

1 聚 ADP核糖聚合酶 [Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制剂

1.1 PARP抑制剂的作用机制 PARP是哺乳动物真核细胞中一种关键的DNA修复酶，具有参与DDR、促进肿瘤相关炎症反应、DNA甲基化、调控细胞能量代谢及凋亡等生理功能。目前，至少有17种不同类型的蛋白质被确定为PARP家族成员，其中只有PARP-1、PARP-2、PARP-3具有DNA修复的功能[6]。细胞中最常见的两种DNA损伤形式为SSB和DSB。SSB主要通过BER途径进行修复，DSB则主要通过HR和NHEJ两种途径进行DNA修复。HR是细胞周期G2期高度活跃的一种高保真的修复途径，修复错误率低，是细胞内主要的修复形式；NHEJ则主要通过G1/S转换和S期起作用，是一种不加选择的DNA连接形式，容易积累错误而导致细胞死亡[7]。PARP可以通过感知SSB被激活，并通过介导BER途径将DNA修复酶募集到损伤位点修复SSB，也能通过与DSB位点结合并募集聚（ADP-核糖）[poly（ADP－ribose），PAR]结合 HR 蛋白通过 HR 途径修复DSB。

目前PARP抑制剂的作用机制主要包括以下几个方面：协同致死效应、对PARP的诱捕作用、阻碍BER途径、激活NHEJ等。其中协同致死效应是近年研究热点，为抗瘤药物的研发提供了重要思路[8]。以PARP抑制剂治疗携带乳腺癌易感基因1/2（BRCA1/2）突变的卵巢癌为例，具体作用机制见图1。DNA受到内、外源性刺激后形成DNA SSB，PARP募集修复蛋白到损伤位点修复DNA SSB。当应用PARP抑制剂后，其与PARP的竞争性结合抑制了修复蛋白在损伤位点的募集，导致复制叉崩解形成DNA DSB。由于BRCA1/2基因介导HR途径修复DNA DSB具有重要作用，因而当BRCA1/2基因突变时HR途径受到抑制，DNA DSB通过NEHJ错误修复导致细胞死亡。

图1 PARP抑制剂协同致死效应治疗携带BRCA1/2突变的卵巢癌的机制

1.2 PARP抑制剂治疗卵巢癌的研究进展 自发现BRCA突变或缺陷的肿瘤细胞对PARP抑制剂敏感以来，已经有3种药物被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于卵巢癌的治疗，包括奥拉帕尼（Olaparid）、尼拉帕尼（Niraparid）以及瑞卡帕尼（Rucaparid），此外维利帕尼（Veliparib）、特拉帕尼（Ttalazoparib）正处于临床研究阶段。奥拉帕尼是研究最广泛，也是第一个被批准用于临床治疗卵巢癌的PARP抑制剂，于2014年12月被批准用于携带胚系BRCA突变（germline BRCA mutation，gBRCAm）三线及以上、化疗后晚期卵巢癌患者的维持治疗；2017年8月被批准用于对铂类化疗敏感的复发性上皮卵巢癌、输卵管癌及原发性腹膜癌的维持治疗。奥拉帕尼的临床批准主要基于大量Ⅲ期临床试验，其中Ⅰ、Ⅱ期临床试验主要通过递增剂量的药物确定了铂类化疗与奥拉帕尼的药物相关性，并确定了最佳剂量[9]。Ⅲ期多中心双盲随机对照试验（RCT）SOLO-1（NCT01844986）和 SOLO-2（NCT01874353）分别将344例新诊断的铂类化疗敏感患者和295例不携带BRCA突变的铂类化疗敏感复发患者随机分为2组（2∶1）接受奥拉帕尼和安慰剂治疗，其试验结果肯定了奥拉帕尼对铂类化疗反应的高级别浆液性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌的疗效[10]。SOLO-3是唯一研究奥拉帕尼单药治疗铂类化疗敏感的复发性卵巢癌患者的Ⅲ期临床试验，其研究结果尚未发表。

瑞卡帕尼于2016年12月被FDA批准用于携带BRCA突变经过两次及以上化疗后的晚期卵巢癌患者，其批准主要基于2项多中心RCT研究10（NCT01482715）和ARIEL2。研究10的ⅡA期试验主要对携带gBRCAm的铂类化疗敏感的复发性高级别卵巢癌患者的安全性和有效性进行评估，结果显示其客观缓解率和疾病控制率分别为74%和77%，目前研究10的ⅡB和Ⅲ期试验正在进行。ARIEL2主要依据杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）程度将192例患者分为BRCA突变、LOH高和LOH低3个亚组，结果表明与LOH低亚组相比，BRCA突变组和LOH高亚组的无进展生存期（progression free survival，PFS）显著延长，LOH是比其他HR基因突变更加敏感的反应预测因子[11]。ARIEL3旨在前瞻性评估与同源重组缺陷（homologous recombination defect，HRD）相关的复发性卵巢癌患者PFS的主要终点[12]。

尼拉帕尼于2017年3月被FDA批准用于治疗铂类化疗敏感的复发性上皮性卵巢癌、输卵管癌及原发性腹膜癌的维持治疗。Ⅰ、Ⅱ期试验主要通过递增剂量试验确定其最佳剂量为每日300 mg并显示实体瘤内的抗癌活性[13]。其批准主要基于多中心RCT试验NOVA，将533例对铂类化疗敏感复发患者以2∶1的比例接受尼拉帕尼和安慰剂治疗，其结果表明在gBRCAm、HRD阳性和HRD阴性3个亚组中PFS中位生存时间与安慰剂组相比均明显延长[14]。与3种批准治疗卵巢癌的PARP抑制剂相关的主要副作用为疲劳、贫血及恶心呕吐，其停药率为10%～15%。骨髓异常增生综合征和急性髓细胞性白血病为主要的严重3～4级不良反应，发生率为1%～2%[10,12,15]。

2 共济失调毛细血管扩张突变（ataxia telangiectasia mutated，ATM）抑制剂

2.1 ATM抑制剂的作用机制 ATM是一种蛋白激酶，主要起对DSB修复应答作用，包括DNA修复、细胞周期检查点的激活、细胞的衰老和凋亡、染色质结构的改变等[16]。ATM、共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白（ataxia telangiectasia and Rad3 related protein，ATR） 及 DNA依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）均为磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）家族成员，在几乎所有哺乳动物中都大量表达，并且在DDR中起重要作用。ATM的激活机制及其与ATR、检查点激酶 1（checkpoint kinase 1，CHK1）、CHK2 在 DDR通路中的作用见图2。ATM主要由DNA DSB激活，激活后被MRN复合物（MRE11-RAD50-NBS1）识别，并在损伤部位将丝氨酸139（S139）磷酸化H2AX为γH2AX。随后γH2AX通过招募更多MRN复合物来募集DNA修复组分如53BP1等，有助于维持DDR信号的稳定。激活ATM的主要底物为CHK2，CHK2通过自身磷酸化和磷酸化MDM2来激活和稳定抑癌基因p53。ATR主要由DNA SSB激活，激活机制为复制蛋白A（RPA）识别并结合已经形成的DNA SSB，ATR则通过其专性结合配偶体ATR-相互作用蛋白（ATRIP）募集到RPA-ssDNA复合物上，同时募集Rad9-Rad1-Hus1（9-1-1）及其复合的拓扑异构酶结合配偶体1（TOPBP1）共同参与。ATR磷酸化最主要的底物为CHK1，ATR/CHK1途径在S期以及G2/M期细胞周期检查点中起重要作用。ATM是一种公认的抑癌基因，由于肿瘤发生的早期阶段常伴有复制应激或端粒缩短等过程从而激活DDR途径，因此ATM被激活所引起的细胞周期停滞可能成为肿瘤发生、发展的关键因素[17]。

图2 ATM、ATR、CHK1、CHK2在DDR中的作用及相关信号通路

2.2 ATM抑制剂治疗卵巢癌的研究进展 在治疗中发现ATM突变患者对放疗和化疗的敏感性差，以及临床前试验证明ATM抑制剂是放疗的强效增敏剂，为ATM抑制剂的开发提供了理论依据[18]。除单药抗瘤作用外，其与免疫抑制剂及DNA-PK的联合也为其临床应用奠定了基础。AZD0516是临床上第一个开发研制的ATM抑制剂，具有高效、口服吸收好以及选择性强的优点，具有较长的血浆半衰期。前期临床试验已经证明AZD0516能够在小鼠异种移植模型中增强伊立替康和奥拉帕尼等DNA DSB诱导剂的功效，目前该药物的Ⅰ期临床试验（NCT02588105）正在进行中，期待其与奥拉帕尼联合应用于晚期卵巢癌的靶向治疗[19]。

3 ATR抑制剂

3.1 ATR抑制剂的作用机制 ATR是增殖细胞中必不可少的结构，主要负责识别DNA损伤并限制损伤DNA检查点激活以阻止受损细胞增殖。ATR主要由SSB激活，激活后通过级联反应阻止G2期细胞增殖。ATR抑制剂在肿瘤细胞中可导致细胞毒性的损伤及有丝分裂突变的积累，而对正常细胞的G1检查点无影响[20]。此外，由于癌细胞的复制应激水平远高于正常细胞，ATR具有稳定复制应激的作用，因此ATR抑制剂可以增强复制应激对肿瘤细胞的杀伤力。

3.2 ATR抑制剂的研究进展 五味子乙素B、NU6027、NVP-BEZ235等为早期的ATR抑制剂，但由于其特异性差限制了其临床应用。VE-822（VX970）是第一个进入临床开发的ATR抑制剂，其单药治疗无效，联合治疗卵巢癌的疗效正在评估中。进行中的Ⅱ期临床试验（NCT02595892）评估吉西他滨单药及联合VE-822治疗铂类耐药的复发性卵巢癌患者的疗效，正在进行的Ⅰ、Ⅱ期临床试验（NCT02627443）则评估吉西他滨、卡铂和VE-822在携带gBRCAm铂类化疗敏感的卵巢癌患者中的疗效[21]。AZD6738是临床开发的第2种ATR抑制剂，具有更好的溶解度、生物利用度和药代动力学特性，这些特性也使其更适合口服。AZD6738单药及与奥拉帕尼或放疗联合治疗卵巢癌在小鼠模型中均显示有效[22]。一项评估AZD6738与奥拉帕尼联合治疗难治性卵巢癌患者的临床试验（NCT03462342）正在进行中。

4 CHK抑制剂

4.1 CHK1、CHK2抑制剂的作用机制 CHK1是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，与CHK2一起在维持DNA完整性方面具有重要作用。CHK1是ATR下游的主要效应器，主要在丝氨酸317及丝氨酸345上被ATR磷酸化，激活的CHK1会触发S期和G2/M期检查点。CHK1对于细胞周期的调控和复制压力的响应以及维持基因组的完整性至关重要[23]。CHK2也是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是ATM下游的主要效应器。在DDR中，CHK2起到DSB的修复和修饰、调节S期和G2/M细胞周期停滞以及不可修复时引发细胞凋亡的作用[24]。CHK抑制剂通过抑制上述途径起到调控细胞周期治疗卵巢癌的作用。

4.2 CHK1、CHK2抑制剂治疗卵巢癌的研究进展已发现具有广谱功效的CHK1抑制剂包括UCN-01、XL844和CBP501，然而由于其缺乏特异性、半衰期长等缺陷限制了其临床应用[23]。随后开发的特异性ATP竞争性CHK1/2抑制剂AZD7762显示具有克服卵巢透明癌细胞系的顺铂耐药性作用，但是由于后期临床试验发现的心肌毒性和不良反应严重限制了其临床开发[25]。Prexasertib（LY2603618）是第一种有效的选择性CHK1/2抑制剂，降低心肌毒性的同时改善了药代动力学特征[26]。在小鼠肿瘤移植模型中，Prexasertib已经显示单药治疗有效性并且能够增加铂类和奥拉帕尼的治疗敏感性[27]。已结束的Ⅱ期临床试验（NCT02203513）招募了28例BRCA野生型高级别浆液性卵巢癌患者，评估静脉注射Prexasertib的疗效。24例可评估患者中有19例出现细胞周期素E（cyclin E）的上调、CCEN1的扩增或蛋白过表达，使其对正常细胞周期破坏更加敏感，从而识别和修复DNA损伤；19例铂类耐药性卵巢癌患者中有11例（58%）受益于Prexasertib的治疗[28]。此外，正在进行的2项临床试验（NCT02203513，NCT 03414047）旨在分别评估Prexasertib单药治疗高级别浆液性卵巢癌和铂类耐药性复发性卵巢癌的疗效。

5 结语和展望

本文综述了 PARP、ATM、ATR、CHK1、CHK2 共5种DDR通路相关蛋白激酶抑制剂的作用机制及其治疗卵巢癌的最新研究进展。除此之外，DNA-PK、WEE1等其他DDR通路相关蛋白激酶的临床试验也在开展中，有作为DNA损伤修复靶标用于治疗卵巢癌的潜力。然而，目前针对DDR通路相关抑制剂的研发还存在以下几方面问题：首先是需要确定更多DDR抑制剂敏感的预测性生物学标志物，并且仅仅预测单药治疗的生物学标志物还远远不够，还要更多关注联合疗法的预测性生物学标志物。现有包括BRCA基因作为PARP抑制剂的生物学标志物已经用于临床治疗，临床前试验表明ATR抑制剂对ATM缺失、ARID1A突变敏感等。其次是如何解决细胞对DDR抑制剂的耐药性问题，以及能否结合对已应用于临床的PARP抑制剂的了解来预测哪种机制对其他DDR抑制剂产生抗性。例如肿瘤细胞可以通过在BRCA1/2等位基因中产生体细胞逆转从而修复HR，以及通过寻找保护复制叉的替代机制从而避免PARP抑制剂的毒性杀伤作用。此外，不同类型DDR抑制剂之间及其与放化疗以及免疫抑制剂的联合治疗也具有广泛研究前景，例如DDR抑制剂和免疫抑制剂抗癌机制不同，联合应用可减少耐药性产生。但是首次临床尝试的联合化疗会造成剂量限制的骨髓抑制等毒副作用，如何减轻副作用成为临床研发的关键。

目前针对卵巢癌的标准治疗方案也在不断改进，包括减瘤手术技术的完善、设备的更新、“最佳减瘤法”定义的不断改进争取完全切除病灶以及铂类/紫杉醇等化疗方案的个体化。除完善标准治疗方案外，联合应用新型靶向治疗药物也为卵巢癌患者提供了多样化治疗方案，其中DDR通路相关抑制剂是最具潜力的靶向药物。新型DDR抑制剂的开发需要借鉴奥拉帕尼等已应用于临床的DDR抑制剂的经验。随着对不同病理类型卵巢癌分子表型研究的深入，新的Ⅰ/Ⅱ期临床试验方向可以基于这些新发现的肿瘤表型和基因型的基础上开展，如CCEN1的上调和过表达与基因组不稳定有关等，而不局限于针对BRCA基因的大型临床研究。