外泌体生物标志物在卵巢癌诊断及预后评估方面的价值——系统评价

李耀威，李力

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是世界范围内普遍高发且死亡率较高的恶性肿瘤，该疾病每年在全世界造成超过15万人死亡，死亡率居妇科恶性肿瘤之首[1-2]。OC患者的5年生存率不到30%，主要是其缺乏早期明确诊断的相关技术及治疗期间肿瘤极易出现抗癌药物耐药性。此外，OC是一种异质性疾病，患者之间在分子水平上存在差异。这些差异通常意味着同一处理方案可能对一些患者有效，但对同一临床及病理分期分型的另一些患者的病情控制效果较差甚至无效。鉴于OC发生、发展过程的复杂性及对高效诊治技术的迫切需要，学者们一致认为，多层次、多角度对OC的发生、发展及肿瘤细胞生物学调控机制进行深入研究从而达到准确、高效诊断及靶向治疗OC的目的有重要推动作用。

近年关于外泌体的研究受到学术界广泛关注。外泌体在肿瘤细胞间信号通讯传导中扮演着重要角色。各种类型的细胞皆可分泌外泌体[3]。肿瘤来源的外泌体可从原发肿瘤细胞转移到肿瘤微环境和远处器官，进而增强肿瘤浸润和转移[4-6]。外泌体携带的信息物质[如微小RNA（miRNA或miR）、长链非编码RNA（lncRNA）、蛋白质、脂质等]可反映其来源细胞的生物学特征；肿瘤患者体内癌细胞将改变其外泌体相关信息的表达水平进而释放到多种体液中（如血液、尿液和腹水等）。有研究提示血浆来源外泌体蛋白的浓度与OC的严重程度和恶性进展密切相关[7]；某些特定的外泌体标志物可被用作相关肿瘤早期诊断和预后的生物标志物[8]。本研究通过对已发表的外泌体在OC诊断及预后方面的相关研究进行系统评价，以期为筛选外泌体相关生物标志物指导OC诊断及预后评价提供思考。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：①研究中的患者必须经病理确诊为OC；②研究涉及人体生物体液来源外泌体；③研究涉及OC患者诊断和（或）预后；④根据相关指标的表达水平，将OC患者分为高表达水平组和低表达水平组，并分析相关指标与OC患者临床预后之间的关系；⑤相关指标与生存状况相关的研究中必须对总生存期（overall survival，OS）和（或）无进展生存期（progression-free survival，PFS）进行了明确定义。排除标准：①OC来源细胞系实验或动物实验研究；②综述类文章、个案报告、会议总结及短评。

1.2 文献检索 通过计算机检索中国知网、维普、万方、PubMed、EMBASE、Web of Knowledge和 Cochrane Library数据库，检索时间均为数据库建库至2019年12月20日。中文检索词包括“卵巢癌”、“卵巢恶性肿瘤”、“外泌体”、“诊断”、“预后”、“生存率”；英文检索词包括“ovarian cancer”、“ovarian carcinoma”、“ovarian carcinomata”、“ovarian tumor”、“ovarian tumour”、“ovarian neoplasm”、“exosomes”、“exosome”、“diagnosis”、“diagnose”、“prognosis”和“survival”。

1.3 文献筛选和资料提取 由2名研究者按纳入与排除标准独立完成文献筛选和资料提取，如遇分歧则通过协商解决。根据预先制定的资料提取表提取资料，资料提取内容主要包括：①基本信息：文献作者、文献发表年份、研究来源（国家）、研究类型、外泌体来源、外泌体分离方法、外泌体鉴定方法、外泌体生物标志物名称、外泌体生物标志物定量方法及研究目的；②诊断方面相关信息：受试者工作特征曲线下面积（areaunderthecurve，AUC）、AUC的95%置信区间（confidence interval，CI）、P 值；敏感度（sensitivity）及特异度（specificity）；③预后方面相关信息：随访时间（follow-up time）、预后指标（OS、PFS、5 年生存率）、风险比（hazard ratio，HR）、HR 的 95%CI及P值。

1.4 文献质量评价 诊断性研究通过QUADAS量表评价纳入研究的质量，该表含有14个条目，每个条目可评价为“是（1分）”，“否（0分）”或“不清楚（0分）”，预后方面的相关研究通过纽卡斯尔-渥太华量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）进行文献质量评分。

2 结果

2.1 文献纳入情况及纳入文献基本特征 通过计算机检索数据库最初共获得439篇文献。随后，使用EndNote X7剔除重复文献252篇。经过阅读文献题目和摘要等步骤排除明显不相干文献共167篇后，对剩余20篇文献进行全文通读及详细评价，其中有10篇文献（包括7篇综述类文献、2篇未涉及诊断或预后情况及1篇数据不完整）被进一步排除。通过手工查询（补充检索）未发现其他文献可纳入本研究，故最终纳入系统评价的文献共10篇，5篇涉及OC患者诊断方面的研究、6篇涉及OC患者预后方面的研究，其中1篇文献同时涉及诊断及预后方面研究。由于纳入的文献在诊断及预后方面尚不宜进行Meta分析，故对纳入的文献进行系统评价。文献检索流程见图1。

图1 文献检索流程图

10篇文献[9-18]中有7篇发表时间在2016—2019年。文献研究来源于中国4篇，其他分别来源于美国、波兰、挪威、德国、以色列及韩国各1篇。研究类型包括5项病例-对照研究和1项病例研究，其他4篇文献未予说明。见表1。

2.2 纳入文献的质量评价 5篇诊断性文献质量评价得分均≥8分，6篇预后方面研究的文献质量评价均≥7分，提示本系统评价纳入文献的质量整体较高，见表2和表3。

2.3 外泌体的提取纯化与鉴定 本研究纳入文献中有1篇文献[10]采用超速离心法、8篇文献[11-18]采用外泌体提取试剂盒、1篇文献[9]采用免疫磁珠捕获法分离纯化外泌体。对于外泌体的鉴定主要依据形态学鉴定，如扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）[10]、透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）[9，14-16，18]及相关蛋白标志物检测如蛋白质印迹法（Western blotting，WB）鉴定标志蛋白[12-13，17]。见表 4。

2.4 外泌体生物标志物用于OC的诊断分析 外泌体分离提取后，需进一步检测相关标志物的含量，WB和酶联免疫吸附测定（ELISA）是研究外泌体内含蛋白质类标志物的常用方法；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）是检测外泌体内含RNA类标志物（如miRNA、lncRNA）的常用方法。另外，还有其他新技术：比如GeneChip miRNA array[9]。本系统评价纳入的4项研究[12，15-17]表明，血清及血浆来源外泌体内含相关miRNA及蛋白质均显示出较好的诊断潜能。例如，血清来源外泌体内含miR-200a、miR-145显示出较高的诊断价值（miR-200a的AUC为0.91,敏感度、特异度分别为83.9%和90.0%；miR-145的AUC为0.91，敏感度、特异度分别为91.7%和75.0%)。另外，血浆来源外泌体内含纤维蛋白原α链（FGA）、凝溶胶蛋白（GSN）、纤维蛋白原 γ链（FGG）也具备一定的诊断价值（FGA、GSN、FGG的AUC分别为 0.85、0.83和 0.74）。见表 5。

表1 纳入文献的基本特征

表2 诊断研究质量评价情况

表3 预后研究质量评价情况

表4 外泌体的纯化及鉴定方法

2.5 外泌体生物标志物用于OC的预后评估 通过qRT-PCR检测到的外泌体内含RNA类标志物（如miRNA、lncRNA）和WB检测的外泌体内含蛋白类标志物可用于预测OC患者的预后。例如，血清来源外泌体内含 miR-373、miR-200b、miR-200c 高表达与OC患者的OS明显缩短密切相关（HR分别为2.1、2.7 和 2.4，95%CI分别为 1.0～4.3、1.3～5.7 和1.2～4.9）；同时miR-200c高表达与OC患者的PFS缩短也密切相关（HR=2.0，95%CI：1.1～3.6）。另外，血清来源外泌体内含lncRNA反义缺氧诱导因子（aHIF）高表达与OC患者的OS缩短密切相关（HR=3.70，95%CI：1.83～7.50）。见表 6。

3 讨论

目前，临床上通常将经阴道超声联合糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）检测作为 OC是否发生的筛查方法。经阴道超声对卵巢和周围器官的成像虽然较经腹部超声辨识度更高，但是在绝经前很难将卵巢肿瘤与功能性囊肿区别开。CA125是一种由体腔上皮分泌的高分子质量蛋白质，可诱导间皮细胞和苗勒氏组织的分化，可以通过其单抗OC125在人体血清中定量CA125。研究表明，80%的上皮性卵巢癌患者血液中CA125明显升高，由于高达50%的Ⅰ期卵巢癌患者血清中CA125水平无明显上升，而在非卵巢恶性肿瘤的其他病理生理状态（例如盆腔炎、腹膜炎、子宫内膜异位症、卵巢良性囊肿、排卵期、月经期及妊娠状态等）和其他恶性肿瘤疾患状态（例如膀胱癌、乳腺癌、肝癌及肺癌等）下血清CA125水平会不同程度上升，故CA125早期诊断效能不佳（敏感度仅27%～60%）[19]。一项随机对照试验提示，经阴道超声和CA125水平监测的联合筛查并未降低OC死亡率[20]。鉴于此，探索更为可靠的肿瘤标志物识别早期OC和监测OC术后患者早期复发或转移情况是必要的、迫切的。

肿瘤细胞间的信号物质通讯传递在恶性肿瘤细胞侵袭、转移方面发挥着重要作用。这些信号物质包括递质、凋亡小体和细胞外囊泡（外泌体）等。鉴别出这些物质及检测其表达水平对临床筛查早期肿瘤及判断患者术后是否存在早期复发及转移有重要指导意义。近年细胞外囊泡（尤其是外泌体）的研究引起了学者们的极大兴趣。外泌体是细胞主动分泌的胞外囊泡，与其他游离分子相比，外泌体能更好地表征其来源细胞的病理生理特征。目前已有相当数量的研究表明，与正常细胞相比，肿瘤细胞会释放更高浓度的外泌体[21-22]。同时，外泌体在肿瘤侵袭和转移的诸多过程中都扮演着重要角色[23-26]。外泌体属于高度稳定的膜状囊泡，可通过降低信噪比（signal-to-noise ratio）来提高其早期诊断肿瘤及监测肿瘤术后患者是否存在早期复发及转移情况的准确性[27]。

表5 用于卵巢癌诊断的外泌体生物标志物

表6 用于评估OC预后情况的外泌体生物标志物

本系统评价表明，在诊断方面，外泌体内含miRNA在区分OC与卵巢良性肿瘤及正常人群方面有较大的潜力，例如血清外泌体内miR-200a、miR-200c、miR-145 等[12，17]；尤其是 miR-200a、miR-145显示出较高的诊断价值（miR-200a的AUC为0.91，敏感度和特异度分别达到83.9%和90.0%；miR-145的AUC为0.91，敏感度和特异度分别达到91.7%和75.0%）。一些外泌体内含蛋白也具有一定的诊断价值[16]，例如血浆来源外泌体内含蛋白FGA、GSN、FGG的AUC分别可达0.85、0.83和0.74。这些结果表明，血液来源外泌体内容物具备诊断OC的潜力，临床科研工作者有必要在这方面继续深入研究进而发现切实高效诊断早期OC的外泌体标志物。在指导卵巢癌患者生存预后方面，外泌体内含miRNA、lncRNA均具备一定的预后指导意义[12，18]。例如OC患者血清来源外泌体内含 miR-373、miR-200b、miR-200c 的高表达与OS缩短密切相关；miR-200c的高表达还与 PFS 缩短密切相关，其 HR（95%CI）为 2.0（1.1～3.6）[12]。尤其是血清来源外泌体内含lncRNA aHIF高表达与OC患者的OS缩短密切相关（HR=3.70，95%CI：1.83～7.50）[18]。这表明对 OC 患者血液来源外泌体内容物进行深入研究进而发现具有指导预后意义的生物标志物可能性很大。

众所周知，敏感度和特异度是评价诊断性试验临床应用价值的最重要指标。目前存在的问题是，鲜有在较大OC患者样本中关于外泌体生物标志物敏感度和特异度的报道。再者，目前人附睾蛋白4（HE4）和CA125被确立为（尚）可用于OC早期诊断和监测复发与转移的血清标志物，如果发现某些外泌体生物标志物可以代替目前的血清学检测指标（HE4、CA125），那么其敏感度和特异度至少应高于目前水平才更有价值。是否确实存在这样的外泌体生物标志物，尚需展开大量的临床研究进行论证。

OC是一种异质性疾病已是一个不争的事实，即使是处于相同TNM分期（T：原发灶，N：淋巴结，M：远处转移）的患者接受相同的治疗方案，他们的预后情况也不尽相同，因此预测哪些患者将从哪些治疗方案（尤其是化学疗法和新辅助化学疗法）中受益是非常重要的。在这种情况下，可能需要检测OC患者体液来源的外泌体生物标志物以协助临床医师判断哪些患者将从新辅助化疗中受益，而其他患者更适合选择其他治疗方案。晚期OC患者的复发和转移风险更高，临床医师应进行更频繁的监测以指导其对相关患者进行医学干预。

综合本系统评价的结果来看，在OC患者体液来源的外泌体内含物中发现一种或多种（甚至多类）差异表达且能有效识别早期OC发生及评估OC患者预后情况的生物标志物（如miRNA、lncRNA、蛋白质等）是很有可能的，尤其是目前关于外泌体内含物lncRNA在OC中的研究报道尚少，这为研究人员选择在这一亚方向进行深入研究提供了广阔空间。

当然，目前外泌体的研究及应用尚存许多挑战[28-30]。其一，虽然目前有多种分离纯化外泌体的方法，但其优劣势均较明显。哪些技术更适用于外泌体标志物的诊断及监测尚未达成共识，目前最常用的技术是超速离心法和排阻色谱法（size exclusion chromatography，SEC），但这两种方法均会导致外泌体中富含其他生物杂质（如可溶性蛋白、脂蛋白等）。多种方法的联合应用，比如SEC和密度梯度离心法相结合可以帮助去除脂蛋白，从而提高外泌体纯度[31-32]；利用包被抗标志物抗体（如CD63、CD9蛋白）的磁珠与外泌体囊泡孵育结合，可将外泌体吸附、分离出来并可以大大提高所得外泌体的纯度[31]，可以部分克服目前存在的问题，但离满足下游实验的要求仍存在差距。其二，从不同来源（性质）的体液中纯化外泌体也面临着多种挑战[32]，许多外在因素可能影响外泌体生物标志物（如miRNA、蛋白质等）的含量[33]。比如，不同来源的生物体液（血清、血浆、腹水等）的收集方法、一天中的采集时间（早、中、晚）、患者是否禁食禁饮、取材于因病情发展自然而成的腹水或是腹腔灌洗液等这些因素均可能影响其生物标志物的表达种类及表达水平。因此，也需要更多的研究来确定这些外在因素对外泌体标志物检测的影响，并且应该逐步形成统一的认识及标准的程序来减小这些外在因素对相关诊断结果的影响。