活血祛瘀药对三棱-莪术治疗胃癌的网络药理学作用机制研究

张磊 程健 余莹 何君君

1.广东省第二人民医院 广州 510405 2.北京大学深圳医院 3.广州中医药大学

胃癌是常见的消化系统肿瘤，目前病因尚未明确，由于早期诊断难、发病率高、死亡率高，在全球范围内广受关注[1-2]。胃癌早期症状缺乏特异性，多数患者确诊时已到中晚期，这加大了胃癌的治疗难度，西医临床多采取手术、化疗或姑息疗法[3]。中医药以其“安全低毒”“固本扶正祛邪”“辨证论治”等优势，在胃癌的治疗中发挥了重要作用。中医多将胃癌归属为“癥瘕”“岩”“积聚”等范畴，活血化瘀是治疗胃癌的基本法则之一，而“三棱-莪术”作为行气活血中药的代表，功专活血祛瘀、消癥散结，广泛应用于胃癌的临床治疗中。

莪术，始载于《药性论》，味辛，性温，具有行气破血、消积止痛之功效。现代药理学研究发现，姜黄素类、莪术醇、挥发油、多糖类成分是莪术主要活性成分[4]。姜黄素类为莪术活血化瘀的主要活性成分[5]；莪术油有广泛的抗肿瘤作用，在胃癌、肝癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌等的治疗中均有效[6]。三棱，最早载于《本草拾遗》，其性平，味辛、苦，具有破血中之气、消积祛瘀止痛之功效。三棱主要活性成分有黄酮类、有机酸和挥发油类，其中如苯丙素、琥珀酸、皂苷类、β-谷甾醇等具有抗炎、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗肿瘤等多重功效[7-8]。中医遣方用药不仅注重“君臣佐使”，而且讲究“七情配伍”，临床疗效及药理研究均表明，三棱、莪术二者配伍，相须为用，在肿瘤、囊肿等实体肿物的治疗中效果更佳。尽管诸多临床案例皆证实了该药对抗胃癌的疗效，然而其具体作用机制尚不明确，这在一定程度上限制了二者的推广与应用。网络药理学作为一门新兴学科，将传统中药与现代药理学、分子生物学、生物信息学相结合，其整体性、系统性的特点与中医药整体合参、辨证论治的原则一致[9]，为从微观角度阐明三棱-莪术药对治疗胃癌的作用机制提供了途径，并为中医药抗癌的客观化、精准化研究提供了证据及新思路。

1 材料和方法

1.1 化学成分构建及筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 检索三棱-莪术药对的所有化学成分，共搜集了111个化合物，其中三棱30个、莪术81个。为更好地筛选药对中的有效化合物，本研究联合口服利用度（oral bioavailability，OB）与CaCo-2细胞渗透性进行三棱-莪术药对活性成分的筛选。其中OB反映的是药物被机体吸收进入循环的百分比，CaCo-2细胞渗透性则可反映小肠上皮细胞对药物的转运效率。基于此，将OB≥30%、CaCo-2细胞渗透性≥0作为化合物分子的筛选标准。

1.2 药物靶点筛选 在TCMSP中查找与筛选出的药对活性分子相对应的蛋白靶点，同时利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/），查询靶点蛋白对应的人类基因名称，进行名称标准化处理后录入Excel表格。

1.3 胃癌靶点筛选 利用人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim） 与 GeneCards（http://www.genecards.org/）搜索关键词gastric cancer，查找与其相关的疾病靶基因，合并2个数据库的搜索结果，去除重复和假阳性的基因，以score＞5作为疾病靶点筛选的标准。

1.4 网络构建 运用UniProt数据库，查询筛选出的三棱-莪术药对中活性分子相关靶点，将药对作用靶点与胃癌相关靶点进行映射，从而获取共同靶点，使用Cytoscape 3.7.1软件构建中药活性成分-胃癌靶点相互作用的网络图。运用String数据库（https://stringdb.org/cgi/input.pl），对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）功能富集及京都基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 为了阐明三棱-莪术药对治疗胃癌的作用机制，将网络中的靶蛋白投射到DAVID生物信息资源库6.8（https://david.ncifcrf.gov/），进行GO功能富集和KEGG通路富集，从生物过程及信号通路角度分析三棱-莪术药对治疗胃癌可能的作用机制，继而绘制靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 药物筛选结果 研究结果表明，三棱-莪术药对中有60个活性成分满足OB与CaCo-2细胞渗透性要求，其中三棱含有18个活性成分，莪术含有43个活性成分，二者共有活性成分1个，为常春（藤苷）配基（MOL000296）。符合筛选条件的60个活性化合物基本信息见表1。

2.2 靶点预测结果 利用UniProt数据库，将TCMSP上检索的活性成分所对应的蛋白靶点，转换成与之对应的人类基因名称，共得到117个靶点基因。检索Gene Cards及OMIM数据库，分别得到靶基因18 250、2 289个，合并去重后得到3 221个。将三棱-莪术药对靶基因与胃癌相关基因进行映射，得到共同靶基因67个。以67个靶基因对应的蛋白作为三棱-莪术药对治疗胃癌的靶点，建立三棱-莪术药对活性成分-胃癌病变靶点网络图，其中黄色菱形代表三棱-莪术药对的活性成分，红色矩形代表胃癌相关靶点。见图1。

2.3 PPI网络图构建 将得到的活性成分作用靶点导入String数据库，进行PPI网络构建。采用Cytoscape 3.7.1软件绘制PPI网络图，设置节点大小与颜色以反映节点自由度值 （degree），边的粗细表示综合分值（combine score），最终获得PPI网络。半胱天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3，CASP3）、c-JunN-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、热休克蛋白90AA1（heat shock protein 90AA1，HSP90AA1）、前列素内环氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2），Degree值分别为33、32、29、28、26， 表明这些蛋白是三棱-莪术药对治疗胃癌的关键蛋白靶点。见图2。

表1 三棱-莪术药对部分活性成分Tab.1 Part of active compounds from Sparganii Rhizoma and Curcumae Rhizoma

图1 成分-靶点网络图Fig.1 Compound-target network

图2 PPI网络Fig.2 PPI network

2.4 GO功能富集分析 通过DAVID软件对三棱-莪术药对治疗胃癌所涉及的67个靶蛋白进行GO功能富集分析。根据P＜0.01、基因频率＞0.05%，确定出10个条目，涉及“类固醇激素受体活性”“转录DNA模板”“细胞增殖调控”“丝氨酸型内肽酶活性”等生物学过程。见图3。

图3 靶基因的GO功能富集Fig.3 GO enrichment of target genes

表2 靶基因的KEGG通路富集Tab.2 KEGG enrichment of target genes

2.5 KEGG通路富集分析 对三棱-莪术药对治疗胃癌所涉及的67个靶蛋白进行KEGG通路富集分析。根据P＜0.01、基因频率＞0.05%，并排除如“小细胞肺癌”“甲状腺激素信号通路”等与胃癌不相关的通路，最后确定出14条通路，包括“肿痛信息痛路”“肿病蛋白多糖”“p53信号通路”等信号通路，并做出KEGG通路富集分析图。见表2及图4。

根据靶点与信号通路之间的联系，建立靶点-通路网络图，其中蓝色三角形表示疾病靶点，红色矩形表示信号通路。见图5。

图4 KEGG通路富集Fig.4 KEGG pathway of target genes

图5 靶点-通路网络图Fig.5 Target-pathway network

3 讨论

胃癌，归属于中医学中“积”“岩”“癥瘕”等范畴。中医病机乃五脏六腑正虚为本，气结、食滞、血瘀、湿阻、寒凝、热壅等为标，脾气亏虚，肝气郁结，气机不行，血运不畅，病久化瘀，入络入脏腑，毒瘀交阻，久积成块，故正虚是胃癌形成的基础，而血瘀是肿块形成的关键因素，治疗应标本兼顾，以益气固本扶正、活血化瘀消积为基本治则。

“三棱-莪术”药对作为临床活血祛瘀的常用药对，二者均能行气活血、化癥散结，相须配伍，散结消积、活血化瘀之力增强，尤适用于胃癌等有形实邪积聚之癥瘕肿块。且现代研究证实，三棱-莪术药对可通过显著抑制内皮细胞增殖、阻滞细胞生长周期、抑制肿瘤细胞生成、直接杀死肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成、阻断信号传导通路等机制起到治疗胃癌的作用[10-12]。尽管现阶段对三棱-莪术二者抗癌的临床疗效已有较多研究报道，但检索国内外文献发现，目前尚无针对三棱-莪术药对抗胃癌的有效化学成分、作用靶点、信号通路及生物学途径等具体机制的研究。因此，借助网络药理学平台明确其发挥临床疗效的活性成分及作用靶点，将成为现代中医药研究的新方向。

本研究发现，三棱-莪术药对活性成分在胃癌的治疗上存在多成分、多靶点、多向作用的特点，针对复杂交叉的肿瘤内环境，中药成分“一对多”发挥多靶点调控的作用，体现出中医整体治疗作用的优势。通过整合分析得出，三棱-莪术药对防治胃癌的关键靶点为CASP3、JNK、ESR1、HSP90AA1、PTGS2等。CASP3在细胞凋亡进程中发挥核心作用，是当前治疗肿瘤的一个重要靶点，其激活后损伤DNA，并破坏细胞内多种蛋白的结构和功能，导致蛋白水解，引起细胞凋亡，以此为途径杀伤肿瘤细胞[13]，使胃癌组织中CASP3表达下调[14]。JNK在不同肿瘤的恶性转化过程中发挥着重要作用，Jun基因编码的c-Jun蛋白是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的组成成员，在调控细胞增殖、分化、侵袭和凋亡方面起关键作用，主要参与MAPK信号通路上游的调控，JNK-MAPK与核转录因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）、两面神激酶/信号传导及转录激活蛋白（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）等多条信号通路协同作用于肿瘤进程[15-17]。胃癌在男女不同性别人群中发病率存在差异，而这种差异在女性绝经后消失，进一步研究发现其与雌激素水平相关[18]。雌激素与胞内雌激素受体（estrogen receptor，ESR）结合，通过激活经典的雌激素信号途径，调控下游基因的表达，从而在胃癌发病进程中发挥多种生物学效应[19]。ESR1基因的内含子包含增强子、启动子等调控转录过程的重要序列，与编码ESR相关，而不同的基因型导致不同个体间ESR的表达、结构、功能等不同，进而影响雌激素发挥生物学效应，诱发胃癌、乳腺癌、卵巢癌等疾病[20-22]。HSP90作为一种高度保守的分子伴侣蛋白，被认为是肿瘤蛋白稳定性的重要调控因子[23]。随着胃癌前病变到胃癌的进展，HSP90的表达呈上升趋势，且在胃癌组织中高表达[24]。而HSP90AA1蛋白作为HSP90家族中一种进化上高度保守的蛋白亚型，与其它分子伴侣协同作用，维持数百种蛋白的稳定性，在胃癌相关蛋白功能发挥中扮演重要调控角色。三棱-莪术药对的主要活性成分（L）-alpha-Terpineol、（R）-p-Menth-1-en-4-ol、oleic acid中均有HSP90的作用靶点，阻断HSP90可阻断胃癌细胞多种促血管生成信号通路，抑制肿瘤生长[25]。PTGS2是花生四烯酸合成前列腺素类物质的关键性限速酶的异构酶，参与调控肿瘤、炎症、凝血等多种生理和病理过程[26-27]。国外研究表明，幽门螺旋杆菌相关的急慢性胃炎与胃上皮细胞中PTGS2的表达有关，PTGS2在幽门螺杆菌感染者的胃上皮细胞中显著升高[28]，且参与了胃癌细胞的恶性增殖、侵袭、转移及免疫抑制[29]。

KEGG通路富集分析表明，三棱-莪术药对主要作用的信号通路有肿瘤信号通路、PI3K-PKB/Akt信号通路、p53信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路等。PI3K-PKB/Akt信号通路被激活后，导致Akt下游靶基因活化，调控E-钙黏蛋白（E-cadherin）、β-连环蛋白（β-cadherin）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、 基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、波形蛋白（vimentin）等的表达，引起细胞外基质降解、细胞间黏附力下降，加速胃癌上皮细胞间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）[30]。 另有研究证实，PI3K-PKB/Akt信号通路对重要抑癌基因p53的表达具有关键调控作用[31]。p53通路可通过对p53等基因的调控，引起胃癌细胞周期阻滞、老化及凋亡。VEGF信号通路包括VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3等不同途径，肿瘤血管生成在肿瘤细胞增殖和转移中起着重要作用，VEGF的作用机理为刺激血管内皮细胞的增殖与迁移，促进肿瘤组织的血管及淋巴管新生，对肿瘤侵袭转移进行调控[32-34]。研究发现胃癌伴随淋巴管侵犯患者癌组织中VEGFC、VEGF-D、VEGFR3的表达强于癌旁组织[35]，VEGF信号通路与消化道肿瘤的生长、转移以及预后密切相关。体外实验显示，三棱-莪术通过降低胃癌发展过程中的关键分子VEGF、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的含量，从而抑制肿瘤生长[11]。 此外，VEGF亦受到PI3K-PKB/Akt信号通路的调控，PI3K-PKB/Akt信号通路可影响包括VEGF在内的多种促血管新生因子，促进肿瘤血管新生[36]。TNF信号通路主要在细胞自稳、细胞凋亡中发挥巨大作用，其中TNF-α作为该通路的核心成员，可维持体内免疫平衡，诱发炎症级联反应，诱导细胞凋亡。TNF-α通过和细胞表面的受体相结合后发挥多种生物学效应，引起下游如抑制性卡巴蛋白 （I-κBα，IkBα）、NF-κB p65亚基蛋白等一系列蛋白的磷酸化，亦可由此激活MAPK、JNK、NF-κB信号通路，导致肿瘤、炎症及免疫性疾病的发生[37]。Rossi等[38]研究发现，胃癌中TNF与其受体2（TNF receptor 2，TNFR2）结合介导细胞存活基因上调，而CASP3、TNFR1等促凋亡基因下调，有利于其促肿瘤作用的发挥。总之，不同的信号通路途径并非独立发挥作用，它们以肿瘤相关基因、细胞因子、酶等为物质基础，相互协调，共同参与机体肿瘤的发病进程。

KEGG通路富集与GO功能富集从不同侧面揭示了三棱-莪术的抗胃肿瘤作用机制，二者相互联系，互为补充。GO功能富集结果提示，三棱-莪术药对主要通过调控细胞增殖周期，实现对细胞核、细胞质、DNA转录、RNA聚合酶Ⅱ启动子等及对类固醇激素受体活性、丝氨酸型内肽酶活性的调控，发挥抗肿瘤生物学作用。药理学研究发现，莪术中的β-榄香烯、姜黄素、莪术醇、莪术二酮、莪术酮等成分通过直接细胞毒性、阻断细胞生长周期、激活机体免疫系统等发挥抗癌作用[12，39]；姜黄素可抑制DNA甲基化，上调E-钙黏蛋白的表达，同时抑制MMP的表达，从而能够抑制肿瘤的侵袭及转移[40-41]；莪术醇可上调B细胞淋巴瘤-2相关x蛋白（B cell lymphoma-2 associated x protein， bax）、下调B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，bcl-2）基因的表达，将胃癌细胞阻滞于S期和G2期，抑制胃癌细胞增殖[42]。三棱中活性成分三棱内酯B、三棱总黄酮、铝络合黑三棱碱三糖苷具有改善机体微环境、抗肿瘤血管新生、调节免疫等功效[43]。三棱总黄酮通过干扰细胞有丝分裂、阻滞细胞周期来抑制肿瘤增殖[44]，亦能下调VEGF等蛋白的表达，诱导胃癌细胞凋亡[45]。赵航等[46]将胃癌根治术后患者分为化疗组及化疗加三棱莪术中药组，结果发现化疗加三棱莪术中药组患者临床症状明显减轻，且肿瘤相关标志物血清VEGF、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、肿瘤抗原125（cancer antigen 125， CA125）、肿瘤抗原724（cancer antigen 724，CA724）含量较化疗组明显降低。由此可见，基础及临床研究从不同角度均验证了三棱-莪术药对胃癌的治疗作用，其作用机制以调控肿瘤细胞生长周期及干预相关信号传导通路为主。

综上所述，胃癌的形成与发展是一个由多基因调控、多因素参与、多信号通路交叉作用的复杂过程，其治疗至今仍然是一个世界性难题[47]。中药以其“多成分、多靶点、多途径”的特点在胃癌防治方面展现出独特优势。本研究运用网络药理学，分析活血祛瘀之代表药对三棱-莪术治疗胃癌的有效活性成分、关键靶点和信号通路，为阐明其抗胃肿瘤的具体作用机制提供了客观依据。