培补二天膏对自发性高血压大鼠血压及心脏重构的影响

戴斌 陈竞纬 张国兴 吴瑛滢

1.南京中医药大学附属苏州医院 江苏，苏州 215000 2.苏州大学

炎性细胞因子主要与机体免疫功能和炎症反应有关，已被证实是多种心血管疾病的起始、进展和临床意义的关键因素。促炎细胞因子能够刺激平滑肌细胞增殖、促进血管活性物质释放、引起内皮功能紊乱[1]，同时还能促进心肌细胞肥大、间质纤维化，参与疾病进程[2]，可见炎性细胞因子与高血压病的发生发展和其靶细胞损害均有关。抑制促炎细胞因子的分泌，是否能改善高血压病患者的症状和预后，是目前研究的方向。培补二天膏是我院陈竞纬主任医师结合叶天士、秦伯未膏方用药经验及自身临证经验所创，主要针对老年高血压病患者。方以天麻钩藤饮及六味地黄丸为基础，选取山萸肉、菟丝子、天麻，牛膝、白术、砂仁、酸枣仁等药物，其中重用山萸肉、菟丝子、天麻为君，起到补肝肾脾、化痰活血的作用，在临床应用过程中控制血压效果颇佳[3]。本研究拟进一步观察其对自发性高血压大鼠 （spontaneously hypertensive rats，SHR）血压、炎性细胞因子和心脏重构的影响，探究其降压及改善心脏重构的可能机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SHR大鼠50只，12月龄，体重（382±29）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司 ［实验动物生产许可证号：SCXK （京）2016-0006］；清洁级雄性Wister kyoto（WKY）大鼠9只，12月龄，体重（357±32）g，来自日本奈良医科大学第二生理学科。实验在苏州大学实验动物中心［实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2012-0045］完成。

1.2 药物与试剂 培补二天膏主要成分：天麻150g、川牛膝150g、白术300g、砂仁50g、五味子150g、酸枣仁150g、山萸肉300g、菟丝子100g、太子参150g、绿萼梅100g、藏红花1g、三七片150g、姜半夏150g、泽泻150g、黄连60g、麦冬150g、焦山楂120g、陈皮100g、东阿阿胶250g、龟甲胶100g，以上药物均购于苏州春晖堂，膏方于实验前1周由苏州市中医医院中药房制备完成。厄贝沙坦片（商品名：安博维，规格：150mg/片）购于杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司 （批号：8A157）；大鼠白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒、大鼠IL-2 ELISA检测试剂盒、大鼠IL-6 ELISA检测试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA检测试剂盒均购于联科生物（批号：EK301B/3、EK302/2、EK306/3、EK382HS）。

1.3 实验仪器 XH100尾动脉血压测定仪购于北京新航兴业科贸有限公司；MedLab-U/4C501数据采集系统购于上海康为医疗科技发展有限公司；冷冻台式离心机为美国Thermo公司产品；酶标仪购于南京宝城生物技术有限公司；RM2016病理切片机购于上海徕卡仪器有限公司；Nikon Eclipse E100正置光学显微镜和Nikon DS-U3成像系统购于日本尼康公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组与给药 将SHR编号后测量动脉收缩压（systolic blood pressure，SBP）作为实验前基础血压，剔除其中SBP＜140mmHg的SHR后，将余下SHR分为5组：阴性对照组，膏方低、中、高剂量组，厄贝沙坦组；另将同月龄WKY大鼠作为WKY组。实验开始第2周阴性对照组1只大鼠突发中风偏瘫，遂剔除；最终各组数量为WKY组9只，膏方低、中、高剂量组各组9只，厄贝沙坦组10只，阴性对照组7只。按人-大鼠体表面积比值折算大鼠的等效剂量，临床等效剂量=临床用药剂量×等效剂量系数，70kg成人与400g大鼠按体表面积折算的等效剂量系数为0.027，低、中、高剂量组为临床等效剂量组的浓度的0.5、1、3倍。即膏方中剂量组大鼠每kg体重用药剂量=人 （70kg）用药剂量×0.027/0.4。

计算得出，膏方低、中、高剂量组大鼠给药量分别为0.58g/（kg·d）、1.15g/（kg·d）、3.46g/（kg·d）， 厄贝沙坦组按上述公式计算得出给药量为10.13mg/（kg·d），以温蒸馏水稀释成混悬液，每只灌胃总量约2mL；阴性对照组及WKY组每日以温蒸馏水10mL/（kg·d），每日每只灌胃总量约2mL。

1.4.2 SBP测定 利用无创尾动脉血压测定仪测定大鼠尾动脉SBP，所有大鼠分别于给药前、给药后每周的周日上午10∶00（或服药后0.5～1h）测定血压，每次血压重复测定3次，取平均值作为大鼠的尾动脉SBP。

1.4.3 ELISA检测血清炎性细胞因子水平 末次给药后，所有大鼠禁食12h，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，于工作台上剪开腹腔，腹主动脉取血约10mL，4℃静置30min分层，4℃下3 000r/min离心15min，分离血清，置56℃水浴灭活30min，分装后置-80℃冰箱保存备用。 以ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平，具体操作依据试剂盒说明书进行。

1.4.4 心脏重量指数（heart mass index，HMI）检测各组大鼠取血后迅速分离心脏，在磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中漂洗，除去血液，去除大血管残根和结缔组织，滤纸吸干后称重，HMI=心脏重量/体重。

1.4.5 心肌病理形态观察 称重完成后的大鼠心脏于4%多聚甲醛中固定24h，常规石蜡包埋，于左心室部位行连续3μm切片，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后镜下观察大鼠心肌细胞病理变化。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，WKY组与阴性对照组SHR比较采用两独立样本t检验，SHR各组间数据比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠实验前后SBP比较 给药前，各给药组SHR与阴性对照组间SBP差异无统计学意义（P＞0.05），WKY组大鼠SBP明显低于阴性对照组（P＜0.01）。与阴性对照组比较，实验第1周后，膏方高剂量组和厄贝沙坦组SBP明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；实验第2周后，膏方高剂量组及厄贝沙坦组SBP仍然低于阴性对照组（P＜0.01，P＜0.05）；实验第3周后，膏方高剂量组SHR血压出现升高，且与阴性对照组差异无统计学意义（P＞0.05），而厄贝沙坦组SBP仍低于阴性对照组（P＜0.01）；实验第4周后，膏方中、高剂量组及厄贝沙坦组明显低于阴性对照组（P＜0.01）。见表1。实验第1周，膏方低剂量组SBP明显高于厄贝沙坦组（P＜0.05），中、高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）；实验第2周，膏方各剂量组与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；实验第3周，膏方低、中剂量组SBP明显高于厄贝沙坦组（P＜0.05），高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）；实验第4周，膏方低剂量组SBP明显高于厄贝沙坦组（P＜0.05），中、高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。

表1 各组大鼠实验前后SBP比较（mmHg）Tab.1Comparison of SBP among groups before and after the experiment（mmHg）

表2 各组大鼠血清IL-1β水平比较（n=6，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of serum IL-1β levels in each group（n=6，pg·mL-1）

2.2 各组大鼠血清炎性细胞因子水平比较

2.2.1 各组大鼠各组大鼠血清IL-1β水平比较 实验4周后，阴性对照组血清IL-1β水平明显高于WKY组（P＜0.01）。与阴性对照组比较，各给药组SHR血清IL-1β水平均降低（P＜0.01）；与厄贝沙坦组比较，膏方各剂量组血清IL-1β水平均升高（P＜0.01，P＜0.05）。见表2。

2.2.2 各组大鼠血清IL-2水平比较 实验4周后，阴性对照组SHR血清IL-2水平高于WKY组（P＜0.05）。与阴性对照组比较，膏方各剂量组和厄贝沙坦组IL-2水平明显降低（P＜0.01）。与厄贝沙坦组比较，膏方各剂量组IL-2水平升高，其中低剂量组差异有统计学意义（P＜0.05），而中、高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表3。

2.2.3 各组大鼠血清IL-6水平比较 实验4周后，阴性对照组SHR血清IL-6水平明显高于WKY组（P＜0.01）。与阴性对照组比较，膏方各剂量组和厄贝沙坦组SHR血清IL-6水平降低（P＜0.01）；与厄贝沙坦组比较，膏方各剂量组IL-6水平均升高，其中低、中剂量组差异有统计学意义（P＜0.01），高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表4。

表3 各组大鼠血清IL-2水平比较（n=6，pg·mL-1）Tab.3 Comparison of serum IL-2 levels in each group（n=6，pg·mL-1）

表4 各组大鼠血清IL-6水平比较（n=6，pg·mL-1）Tab.4 Comparison of serum IL-6 levels in each group（n=6，pg·mL-1）

2.2.4 各组大鼠血清TNF-α水平比较 实验4周后，阴性对照组SHR血清TNF-α水平明显高于WKY组（P＜0.01）。与阴性对照组比较，膏方低、中剂量组TNF-α水平差异无统计学意义（P＞0.05），而膏方高剂量组及厄贝沙坦组TNF-α水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；与厄贝沙坦组比较，膏方各剂量组TNF-α水平都明显升高（P＜0.01，P＜0.05）。 见表5。

2.3 各组大鼠心脏重量、体重及HMI比较 实验4周后，各组大鼠体重比较差异无统计学意义（P＞0.05）。阴性对照组心脏重量及HMI均明显高于WKY组（P＜0.01）。与阴性对照组比较，膏方高剂量组及厄贝沙坦组心脏重量及HMI降低（P＜0.05）。与厄贝沙坦组比较，膏方低剂量组HMI升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其他各剂量组心脏重量和HMI差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表6。

2.4 各组大鼠心肌病理形态观察 光镜下观察可见阴性对照组心肌细胞肥大，核增大，排列紊乱，部分心肌细胞坏死；间质纤维组织增生，大量炎性细胞浸润，部分脂肪变性。膏方低剂量组心肌细胞肥大，个别细胞核增大，排列紊乱；大量炎性细胞浸润，纤维组织增生；中剂量组心肌细胞中度肥大，排列较整齐，炎性细胞浸润较阴性对照组及低剂量组明显减少，少量纤维组织增生；高剂量组心肌细胞肥大减轻，排列较整齐；间质炎性细胞浸润明显少于阴性对照组，可见少量纤维增生。厄贝沙坦组心肌细胞轻度肥大，细胞排列紧密整齐；间质炎性细胞浸润明显减少，未见明显纤维增生。见图1。

表5 各组大鼠血清TNF-α水平比较（n=6，pg·mL-1）Tab.5 Comparison of serum TNF-α levels in each group（n=6，pg·mL-1）

表6 各组大鼠心脏重量、体重及HMI比较Tab.6 Comparison of heart weight,weight and HMI in each group

3 讨论

高血压病是一种常见的疾病，病因及其病理生理尚不明确。在传统医籍中并没有该病的记载，因其常伴随头晕头胀或头痛等症状，故多将其归为传统医学的“眩晕”“头痛”的范畴。中医常认为它与禀赋不足、情志不遂、饮食失宜、劳倦过度等因素有关，其病机总属本虚标实，虚者常为肝肾阴虚、脾虚不运，实者常为痰浊、血瘀、气郁、肝风等等，其中主要责之于肝、肾、脾。对于老年高血压病患者而言，病机或有标实显著，然本虚甚者更占多数。《素问·上古天真论》云：“（丈夫）五八肾气衰，发堕齿槁……（女子）五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕……”说明脾肾等脏腑功能会随年龄增长而逐渐发生不可逆的衰退，这也是老年高血压病患者的本质特征。膏方以其突出的滋补特性更适宜此类以本虚为主的轻中度老年高血压患者。培补二天膏是以六味地黄丸与天麻钩藤饮为基础方，结合吴门医派膏方经验创新而来，以补肝肾脾、化痰活血等治法为主，契合老年高血压病患者的根本病机，在临床治疗中也取得较好疗效。本研究选取的实验动物为高龄SHR或WKY大鼠，也是为了尽可能贴近膏方的适用人群。

近年来的研究显示，低度全身性炎症对高血压的发生发展起关键作用[4]，而炎性细胞因子在其中扮演着重要的角色。作为促炎细胞因子，IL家族分子已被证实能够通过不同机制升高血压，如IL-1β能够刺激血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖，引起血管内皮细胞形态变化，改变细胞内骨架结构，并能够增加VSMC细胞膜钙离子通透性，促进钙离子内流，促使血压升高[5]。IL-2能够促进单核细胞释放血管活性物质，如血栓素A2等；同时可产生氧自由基，直接引起平滑肌收缩，或抑制内皮依赖性舒张因子表达或导致其失活，最终升高血压[5]。IL-6则通过增加白细胞与血管内皮细胞的黏附，提高血管阻力[6]；还能够引起内皮功能紊乱[7]，促进平滑肌增殖，提高细胞内钙离子浓度，加强血管收缩[8]；同时能够上调血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）受体表达，发挥缩血管作用[9]。

图1 各组大鼠心肌细胞病理结果比较（HE染色）Fig.1 Comparison of pathological results of rat myocardial cells in each group（HE staining）

另一方面，心脏重构作为高血压病的靶器官损害，其病理改变主要包括心肌细胞肥大[10]、心肌细胞纤维化与凋亡[11]、心肌间质纤维化[12]和冠状动脉内膜玻璃样变、内皮增生、中膜增厚、外膜纤维化[13]，以上病理生理过程也与IL家族密不可分。IL-6过表达可能通过激活转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 介导的 基质 金属蛋 白 酶2（matrix metalloprotein2，MMP2）/MMP3信号通路，诱导肌纤维母细胞增殖、分化和纤维化[14]。而IL-6拮抗剂能使特定培养基中心肌细胞表面积减少，并抑制成纤维细胞增殖，可见IL-6有促进心肌细胞肥大，诱导细胞间质纤维化的作用[15]。研究发现，IL-1β通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 （cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）诱导小鼠心肌细胞凋亡[16]。白细胞介素-1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）介导的髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性信号通路主要激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）[17]， 从而活化组织中的MMP，促进间质纤维化，同时通过反馈调节AngⅡ的合成，间接影响心室重构[18]。IL-18能迅速诱导MMP基因（尤其是MMP-9）表达，促进心肌细胞间质降解，导致心肌细胞间质纤维化[19]；并且能够增强TNF-α诱导的心肌细胞凋亡，还能够诱导心脏内皮细胞死亡[20]。此外最重要的一点是，高血压心脏重构过程与血压直接相关，血压的降低能够直接改善心脏重构。

作为本研究的阳性对照药物，厄贝沙坦通过拮抗AngⅡ1型受体发挥降压疗效，且能抑制AngⅡ。NF-κB信号通路作为炎性细胞因子合成的关键通路[21-22]，能够被AngⅡ迅速激活[23]。因此通过抑制AngⅡ，厄贝沙坦能够有效地抑制促炎细胞因子的生成，通过控制血压、抑制炎症反应，改善心脏重构。

本研究结果表明中、高剂量的培补二天膏具有明确的降压疗效，高剂量膏方能够减低大鼠HMI，且病理学显示膏方高剂量组及厄贝沙坦组心肌细胞肥大减轻，间质炎性细胞浸润较阴性对照组及膏方低剂量组明显减少，可见高剂量膏方能够改善老年SHR的心肌炎症反应，减轻心肌细胞肥大，由此提示高剂量膏方能够改善SHR心脏重构。血清炎性细胞因子水平的检测则提示，培补二天膏能够不同程度降低SHR血清IL-2、IL-1β、IL-6水平，而只有高剂量膏方能够降低血清 TNF-α水平。由上可以推测，培补二天膏对IL家族的干预较明显，而对TNF-α的影响相对较小。

综上所述，本研究提示培补二天膏降低血压的疗效确切，而且能够降低SHR血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平，高剂量时还能够改善SHR心脏重构，由此推断其对心脏重构的改善作用可能是通过降低血压及炎性细胞因子水平实现的。