lncRNA HOXA-AS2在视网膜母细胞瘤中的预后价值

平俐 盛小红 辛向阳

视网膜母细胞瘤是儿童最常见的眼内恶性肿瘤，约占所有儿童恶性肿瘤的3%[1]。目前大部分视网膜母细胞瘤患儿的预后较差，主要与就诊不及时，且该病缺乏有效的治疗手段有关[2，3]。此外，目前对视网膜母细胞瘤的预后预测尚不够准确，特别是对于微转移风险的评估[4]。因此，对视网膜母细胞瘤的分子标记物进行研究，鉴定出能预测其预后的分子标记物，并作为潜在的靶标进行药物设计，有深远的意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度超过200个核苷酸的、具有高度异质性的一类非编码RNA[5]。越来越多证据支持lncRNA参与了广泛的肿瘤生物学行为，包括细胞增殖、凋亡和侵袭[6]。目前多种lncRNA被鉴定出在视网膜母细胞瘤的发生发展中扮演着抑癌基因或癌基因的角色[7，8]。本研究拟首先对就诊本科室的视网膜母细胞瘤患儿中的lncRNA测序数据进行分析，筛选出新型lncRNA HOXA-AS2，进一步扩大样本以验证其预后价值。

资料与方法

一、一般资料

随机选取2018年5月就诊我科的3例(3只眼)视网膜母细胞瘤患儿的癌组织及同期就诊的的3例(3只眼)正常视网膜样本，对两组间的组织样本进行lncRNA表达谱分析，筛选差异表达lncRNA。然后挑选出HOXA-AS2，回顾性选取标本库中2012年1月至2017年12月就诊我科的60例视网膜母细胞瘤的手术标本进行PCR验证，根据HOXA-AS2表达水平进行分组，评估HOXA-AS2对视网膜母细胞瘤的诊断效能及其表达水平与预后的关系。最后预测HOXA-AS2的靶基因，并对靶基因进行生物功能基因本体(gene ontology,GO)富集。

二、患者纳入和排除标准

1.纳入标准：(1)术后病理确诊视网膜母细胞瘤；(2)术后生存随访数据和组织标本库质量合格。

2.排除标准：(1)合并多原发癌或其他恶性肿瘤史；(2)拒绝参与研究者。

本研究已取得我院伦理学委员会审核并通过，所有纳入者自愿参与，已签订知情同意书。

三、试剂和设备

NanoDrop2000分光光度计(美国Applied Biosystems公司)，StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(Thermofisher)，Trizol试剂(碧云天公司)，PrimeScript RT reagent Kit(Takara)，SYBR Premix ExTaq II Kit(Takara)。

四、RT-PCR

对患者术后进行标本取材，于30 min内-80 ℃保存。按照RNA提取Trizol试剂盒说明书提取总RNA，并定量测定RNA浓度和纯度。当吸光度A260 nm/A280 nm为1.9～2.1时，说明纯度达标，选择用于进行进一步分析。对HOXA-AS2进行qRT-PCR验证，根据PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix ExTaq II Kit说明书逆转录提取RNA后进行qPCR，以GAPDH作为内参。

五、生物信息学分析

运用Multi Experiment Matrix(MEM)在线数据库进行HOXA-AS2的靶基因预测，该网站基于多数据集的共表达相关性进行靶基因预测，选择前200名靶基因，运用STRING网站进行GO分析[9]。

六、统计学方法

计数资料采用卡方检验进行比较。总生存率分析采用Kaplan Meier法，并运用用Log Rank法比较，预后相关多因素分析采用Cox风险回归模型，采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、视网膜母细胞瘤的差异lncRNA及HOXA-AS2表达

对3例视网膜母细胞瘤和3例健康对照组的视网膜组织的lncRNA表达谱进行比较分析，共筛选出141个差异lncRNA，其中上调lncRNA共110个，下调lncRNA共31个(表1，为前5名差异基因)。选择差异倍数最大的HOXA-AS2(logFC 4.54，P=3.94E-07)作为后续研究的进一步验证。

表1 3例视网膜母细胞瘤和3例对照组的视网膜组织的差异lncRNA(前5名)

二、HOXA-AS2对视网膜母细胞瘤的预测价值

进一步搜集于2012年1月至2017年12月就诊我科的60例视网膜母细胞瘤的手术标本进行qRT-PCR验证，年龄(2.5±1.8)岁(0.6～6岁)，以HOXA-AS2表达中位值为截点进行分组，结果提示： 视网膜母细胞瘤HOXA-AS2高表达组的3年OS明显低于HOXA-AS2低表达组，差异有统计学意义(51.2%比96.0%，P=0.006，图1)。

三、HOXA-AS2低表达组和HOXA-AS2高表达组临床病理资料比较

对HOXA-AS2高表达组和HOXA-AS2低表达组的临床病理资料进行比较，结果提示，两组间不同性别、组织分型、肿瘤分期和视神经侵犯相比，差异无统计学意义(均P>0.05)。HOXA-AS2高表达组的脉络膜浸润率高于HOXA-AS2低表达组,差异有统计学意义(35.5%比10.3%，P=0.021)。

四、视网膜母细胞瘤患儿的总生存期预后多因素分析

进一步对视网膜母细胞瘤患儿的总生存期(overal survival,OS)相关因素进行Cox风险回归多因素分析，结果提示：只有HOXA-AS2表达水平入选回归方程(OR=2.632，95%CI：1.228-5.641，P=0.013)，是视网膜母细胞瘤患者预后总生存期的独立危险因素。

表2 HOXA-AS2低表达组和HOXA-AS2高表达组临床病理资料比较

表3 视网膜母细胞瘤患者的预后进行Cox风险回归多因素分析

五、HOXA-AS2的靶基因

运用Multi Experiment Matrix(MEM)在线数据库进行HOXA-AS2的靶基因预测，采用STRING数据库对HOXA-AS2的靶基因数据集进行GO分析，结果提示，HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎发生后脑发育中前Hox基因的激活”的生物学过程中(FDR=5.60E-06)(图2)。

讨 论

随着二代基因测序技术的发展与成熟，研究者发现很多疾病的发生与发展和lncRNA的异常表达有关，临床中lncRNA常被应用于诊断和预测，但其参与的相关机制尚不明了。目前关于视网膜母细胞瘤的lncRNA表达谱研究较少[10]，本研究首先通过对视网膜母细胞瘤患儿和健康对照组的lncRNA表达谱进行比较，筛选出141个差异lncRNA，其中上调lncRNA共110个，下调lncRNA共31个，有助于为今后视网膜母细胞瘤的lncRNA研究提供参考。

我们进一步选择差异倍数最大的HOXA-AS2(logFC 4.54，P=3.94E-07)进一步验证。lncRNA HOXA-AS2是一个长度为1048bp的长链反义lncRNA。由于其转录本位于HOXA3和HOXA4之间的HOXA集落中，HOXA-AS2被认为广泛参与了多种癌肿的病理生理过程，并在多种癌肿中表达上调，如肝癌[11]、胃癌[12]和结直肠癌[13]等。此外，HOXA-AS2在这些癌肿中均具有预后预测价值，但其在视网膜母细胞瘤中的预后价值目前尚无研究探讨。我们进一步搜集既往就诊我科的60例视网膜母细胞瘤的手术标本进行qRT-PCR验证，发现HOXA-AS2高表达组的3年OS低于HOXA-AS2低表达组,(51.2%比96.0%，P=0.006),进一步对临床资料进行分析，发现性别、组织分型、肿瘤分期和视神经侵犯与HOXA-AS2表达无关。HOXA-AS2高表达组的脉络膜浸润率高于HOXA-AS2低表达组(35.5%比10.3%，P=0.021)，提示HOXA-AS2高表达的视网膜母细胞瘤生物学行为较差，侵袭性较强，HOXA-AS2在视网膜母细胞瘤的进展过程中扮演癌基因的角色。Zhang等[14]发现体外敲除HOXA-AS2，可通过导致G1期阻滞，促进胆管癌细胞的凋亡，从而降低其增殖水平。在视网膜母细胞瘤方面，HOXA-AS2的促癌机制尚无研究，本研究对HOXA-AS2的靶基因数据集进行GO分析，结果提示，HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎发生后脑发育中前Hox基因的激活”的生物学过程中(FDR=5.60E-06) 提示其可能通过调节HOX家族表达参与视网膜母细胞瘤的发生发展。HOXA-AS家族另一个成员HOXA11-AS通过吸附miR-506-3p，使其靶基因NEK6上调，从而促进视网膜母细胞瘤增殖[15]。HOXA-AS2在视网膜母细胞瘤方面的促癌机制及其靶标设计值得进一步研究。

目前HOXA-AS2在乳腺癌[16]和胰腺癌[17]方面的预后价值已经得到证实。为了进一步探讨HOXA-AS2是否具有视网膜母细胞瘤的预后预测价值，我们对可能影响视网膜母细胞瘤患儿的OS的相关因素进行Cox风险回归多因素分析，发现只有HOXA-AS2表达水平入选回归方程，较高的HOXA-AS2表达水平(OR=2.632，95%CI：1.228-5.641，P=0.013)是视网膜母细胞瘤患者预后(OS)的独立危险因素。提示HOXA-AS2有望成为视网膜母细胞瘤的预后标记物。

本研究筛出了HOXA-AS2是视网膜母细胞瘤潜在的生物标记物，发现视网膜母细胞瘤HOXA-AS2高表达组的3年OS明显低于HOXA-AS2低表达组，发现视网膜母细胞瘤组织HOXA-AS2高表达可作为视网膜母细胞瘤不良预后的独立因素，并且HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎发生后脑发育中前Hox基因的激活”的生物学过程中，因此HOXA-AS2有望成为视网膜母细胞瘤的预后标记物。