老年糖尿病视网膜病变患者血清中HIF-1α、miR-210水平与微血管损伤的关系

朱祥祥 陈震 饶卓群 王琼 杨扬

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者体内内分泌失调造成的眼部神经和微血管病变，以视力下降、视物模糊、失明为主要临床表现[1]。但DR诊治手段缺乏特异性，因此，寻找有效诊治DR的指标极其重要。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是一种机体应答缺氧环境的重要调节因子，在DR中呈高表达，经双丹明目胶囊治疗后，HIF-1α表达水平下调，推测HIF-1α可能在DR产生新生血管的过程中发挥重要作用[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类具有调控基因表达的非编码RNA分子，参与多种糖尿病相关疾病的发生与发展，有望成为糖尿病相关疾病的生物标志物[3]。患有DR后，患者体内miRNA表达水平产生明显改变，miR-126有望成为增值DR病情评估的重要指标[4]。微小RNA-210(miRNA-210，miR-210)是一种特异性缺氧miRNA，其在Ⅰ型糖尿病患者血浆中显著上调，其可能参与糖尿病相关疾病的早期发作[5]。基于此，本研究通过观察HIF-1α、miR-210在老年DR患者血清中的表达情况、分析两者关系及与微血管损伤的关系，以期为早期防治DR提供可靠依据。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年2月至2018年11月诊治的DR患者122例进行研究(DR组)，其中男性49例，女性73例；年龄48～74岁，平均年龄(67.64±5.81)岁；并选择本院同期治疗的单纯糖尿病患者127例进行对照研究(单纯糖尿病组)，其中男性52例，女性75例；年龄46～75岁，平均年龄(66.95±5.72)岁。两组性别、年龄方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。收集两组体质指数、收缩压、舒张压、吸烟史、尿微量白蛋白、空腹血糖、糖化血红蛋白、糖尿病病程、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等各方面的基本资料。根据检眼镜检查和眼底荧光血管造影将DR患者分为57例非增生型糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)组(NPDR组)和65例增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)组(PDR组)。

诊断标准：符合糖尿病分类和诊断标准[6]及中华医学会眼科学会眼底病学组制定的DR相关诊断和分类标准[7]。纳入标准：(1)符合DR或经眼底检查无视网膜病变的单纯糖尿病诊断标准者；(2)具有完整的诊断资料，且病情诊断明确；(3)自愿参与且中途无退出研究者。排除标准：(1)合并原发性肾脏功能障碍者及其他肝肾功能疾病者；(2)患有心脑血管、精神类、神经类病变者；(3)合并肿瘤、免疫类疾病者；(4)患有糖尿病其他急性并发症者；(5)患有其他眼部疾病者。所有患者或者家属签署知情同意书，且本院伦理委员会批准该项研究后实施，研究方法符合《赫尔辛基宣言》。

二、主要试剂与仪器

TRIzol 试剂(货号：5301100)购买于上海名劲生物科技有限公司，Transcriptor One-Step RT-PCR Kit(货号：4655885001)购买于上海康朗生物科技有限公司，Taqman Universal master mix(货号：4347166)购买于天津泰泽兴业生物科技有限公司。

紫外分光光度计(型号：UV-2102PCS)购买于石家庄成达飞科学器材有限公司，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：美国ABI StepOnePlus)购买于上海凌仪生物科技有限公司；流式细胞仪(型号：BD FACSCalibur)购买于上海普迪生物技术有限公司。

三、方法

1.样本采集及预处理：采集单纯糖尿病患者及DR患者空腹肘静脉血8 ml，均分成两份。一份用于检测所有研究对象内皮细胞(endothelial cells，ECs)、内皮组细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)含量；另一份置于5 ml EP管中，静置约40 min，3500 g离心12 min，分离上层血清，分装，密封，保存于-80 ℃冰箱中，用于检测HIF-1α、miR-210、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相对表达水平。

2.qRT-PCR法检测血清中HIF-1α、miR-210、VEGF表达水平：从-80 ℃冰箱中取出1.3.1预处理的血清样本，冰上溶解，无菌环境中，按照TRIzol法提取所有研究样本总RNA，利用紫外分光光度计检测所有血清样本总RNA纯度、浓度。依照Transcriptor One-Step RT-PCR Kit逆转录试剂盒说明书合成cDNA。依据TaqMan MicroRNA Assay、Taqman Universal master mix说明书流程将所得cDNA进行PCR检测。miR-210以U6为内参，HIF-1α、VEGF以β-actin为内参，其对应引物序列见表1所示。以2-△△CT法计算HIF-1α、miR-210、VEGF表达水平。

3.ECs、EPCs水平检测：采用流式细胞仪检测外周血ECs、EPCs含量，求百分比，评估微血管损伤程度。

四、统计学方法

结 果

一、两组基本资料比较

与单纯糖尿病组相比，DR组DR患者收缩压明显升高，吸烟史比例和尿微量白蛋白含量明显增高，糖尿病病程明显延长(P均<0.05)。见表2。

二、两组血清HIF-1α、miR-210、VEGF水平及ECs、EPCs含量比较

与单纯糖尿病组相比，DR组血清HIF-1α、miR-210、VEGF表达水平均明显升高(P均<0.05)，外周血ECs含量明显增高(P<0.05)，EPCs含量明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 两组血清HIF-1α、miR-210、VEGF水平及ECs、EPCs含量比较

三、不同老年DR患者血清HIF-1α、miR-210、VEGF水平及ECs、EPCs含量比较

与NPDR组相比，PDR组患者血清HIF-1α、miR-210、VEGF表达水平均明显升高(P均<0.05)，外周血ECs含量明显增高(P<0.05)，EPCs含量明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 不同DR患者血清HIF-1α、miR-210、VEGF水平及ECs、EPCs含量比较

四、老年DR患者血清中HIF-1α、miR-210与VEGF、ECs、EPCs水平的关系

经Pearson相关性分析可知，DR患者血清中HIF-1α表达水平均与VEGF表达水平、ECs含量呈正相关(r=0.528、0.415，P均<0.05)，与EPCs含量呈负相关(r=-0.364，P<0.05)。

DR患者血清中miR-210表达水平均与VEGF表达水平、ECs含量呈正相关(r=0.422、0.513，P均<0.05)，与EPCs含量呈负相关(r=-0.436，P<0.05)。见表5。

表5 DR患者血清中HIF-1α、miR-210与外周血ECs、EPCs含量的关系

五、老年DR患者血清中HIF-1α、miR-210的相关性

Pearson法分析显示，老年DR患者血清中HIF-1α与miR-210表达水平呈正相关(r=0.518，P<0.05)。见图1。

六、Logistic回归分析老年DR发生PDR的影响因素

以DR是否发生PDR为因变量，收缩压、吸烟史、尿微量白蛋白、糖尿病病程、HIF-1α、miR-210、VEGF为自变量纳入Logistic回归分析，结果显示，收缩压、尿微量白蛋白、糖尿病病程、HIF-1α、miR-210、VEGF是老年DR发生的危险因素(P<0.05)。见表6。

表6 影响老年DR发生PDR的Logistic回归分析

讨 论

DR是以慢性缺血、缺氧为视网膜组织病理变化基础，由多种血管生长因子及抑制因子相互作用引起血管内皮功能异常、微血管瘤、新生血管过度增生及微血管损伤所引发的糖尿病并发症，发生率居高不下，可导致失明，给患者及其家庭带来沉重的心理及经济负担[8]。因此，寻找可评估DR的指标，分析其与微血管损伤的关系，并有效控制老年DR发生的影响因素，可有效提高患者生活、生存质量。

HIF-1α是缺血、缺氧刺激细胞产生的特异性转录因子，可应对细胞的缺氧状况[9]。刘鹏等[10]研究显示，HIF-1α在非增生型期DR中高水平，经复方血栓通联合羟苯黄酸钙治疗后，表达水平下降，可能参与非增生期DR的发生发展，可作为评估非增生期DR进展的生物学指标。HIF-1α、VEGF在DR中表达水平明显上调，且两者表达相互影响，通过干扰HIF-1α或使VEGF沉默，从而减少VEGF表达，有效抑制血管新生，HIF-1α有望成为防治DR的靶指标[11]。Zhang等[12]研究发现DR中视网膜血管生成与HIF-1α水平升高密切相关，通过调节HIF-1α水平，进而抑制血管新生，有效阻止DR的发生发展，为治疗DR提供新思路。以上研究表明，DR发病进程与HIF-1α、VEGF表达失调关系密切，且与HIF-1α、VEGF具有一定相关性。本研究中DR组患者血清HIF-1α、VEGF表达水平均明显高于单纯糖尿病组患者，提示HIF-1α、VEGF可能在DR发生发展过程发挥重要作用。

miRNA在个体发育、机体代谢、信号传导等生物学过程起到重要调节作用，可作为糖尿病及糖尿病肾病、糖尿病冠心病、DR等糖尿病相关疾病的诊断标志物和防治指标[13]。miR-15a表达下调可促进视网膜血管新生和细胞炎症反应，miR-15a可通过调节血管生成及炎症反应进而影响DR疾病的发生发展[14]。miR-93在DR中的表达水平明显高于2型糖尿病患者，miR-93影响DR的发展进程，有望成为诊断DR的生物学指标[15]。以上研究表明，miRNA表达失调可能与DR的发病进程关系密切。miR-210在糖尿病冠心病患者血浆中的表达水平明显高于单纯糖尿病者，可作为糖尿病患者是否合并冠心病的评估标准[16]。miR-210在糖尿病合并缺血性脑卒患者血浆中的表达失调，有望作为诊断糖尿病合并缺血性脑卒中有效指标[17]。本研究中miR-210在DR患者血清中的表达水平明显高于单纯糖尿病患者，提示miR-210在DR的发展进程中起到一定作用。

血清VEGF水平可作为糖尿患者患有微血管损伤类疾病的诊断标准，ECs、EPCs与血管新生有关，且两者可作为微血管内皮功能指标，VEGF、ECs在DR患者微血管损伤中呈高水平，EPCs呈低水平，VEGF表达水平与ECs、EPCs有关联，VEGF在DR患者形成微血管损伤过程中和血管内皮功能相关[18]。本研究中ECs在DR患者外周血中呈高水平，EPCs呈低水平，提示外周血ECs、EPCs比例失调可能影响DR发病进展。

进一步分析显示，PDR组患者血清HIF-1α、miR-210、VEGF、外周血ECs水平均明显高于NPDR组，EPCs含量明显低于NPDR组，提示HIF-1α、miR-210、VEGF、外周血ECs水平随DR发展过程呈上升趋势，EPCs水平呈下降趋势，HIF-1α、miR-210、VEGF、外周血ECs、EPCs水平可以评估DR病情程度。本研究中DR患者血清中HIF-1α、miR-210表达水平均与VEGF、ECs水平呈正相关，均与EPCs水平呈负相关，提示HIF-1α、miR-210可能均与VEGF、ECs、EPCs相互作用共同影响DR疾病发生发展过程。本研究显示，收缩压、尿微量白蛋白、糖尿病病程、HIF-1α、miR-210、VEGF是老年DR发生PDR的危险因素，提示收缩压、尿微量白蛋白、HIF-1α、miR-210、VEGF水平升高，糖尿病病程延长均可增加PDR发病几率，及时监控收缩压、尿微量白蛋白、HIF-1α、miR-210、VEGF水平，有利于及时诊断和防治GDM的病情进展。

综上所述，老年DR患者血清HIF-1α、miR-210呈高表达，可加重微血管损伤，两者均可能参与DR的发生与发展。但本研究存有一些不足之处，即取样量较少，可能会致使结果出现偏差，后续将进一步扩大样本取样量进行深入研究。