lncRNA PVT1及miR-26b在增生型糖尿病视网膜病变患眼玻璃体、增生膜中的表达研究

隋文婕 张晶晶 汤庆丽 陈鑫 唐于荣

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种由血糖升高引起的视网膜微血管损伤类疾病，属于糖尿病并发症。近年来，DR发病率呈较高水平且逐年上升[1]。DR患者主要症状有视网膜前出血、视网膜脱离、不同程度视力障碍等，若病情不能得到及时控制，DR可能发展为有新生血管形成的增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。PDR可加剧患者视网膜出血，引发视网膜脱离等其它增生型病变，严重影响患者健康[2]。有研究表明，上皮间充质转化过程(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是影响PDR进展中新生血管形成关键因素[3]。Shen等在宫颈癌中研究发现，长链非编码RNA 浆细胞瘤变异易位基因1(long non-coding RNA plasmacytoma variant translocation，lncRNA PVT1)可通过调节EMT，影响癌细胞增殖[4]。有研究表明，微小RNA-26b(micro RNA-26b，miR-26b)在胶质瘤细胞中显著下调，可参与调控替莫唑胺耐药介导的EMT过程[5]。由于lncRNA PVT1和miR-26b在PDR中表达水平及意义尚不清楚，本研究通过检测PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1和miR-26b表达水平，分析与相关临床指标相关性，探讨二者与PDR进展关系，为进一步深入研究PDR相关影响机制和临床诊治提供一定帮助。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年3月至2019年3月本院收治的单眼发病的PDR患者58例为研究对象(PDR组)。其中男性31例，女性27例，年龄41～75岁，平均年龄(53.29±16.31)岁。根据中华医学会眼科学分会眼底病学组诊断标准[6]，将入组PDR患者分为：Ⅴ期33只眼，Ⅵ期25只眼。纳入标准：①确诊为2型糖尿病引起的PDR病变；②需行患眼玻璃体切除术；③临床资料完整。排除标准：①有其他眼部手术史；②合并患有高血压；③合并患有恶性肿瘤及其他器官重大疾病者。另选取同期因特发性黄斑裂孔行玻璃体切除术患者35例作为对照组。其中男性19例，女性16例，年龄40～73岁，平均年龄(52.87±15.64)岁。对照组均为单眼发病，排除伴有恶性肿瘤、高度近视及其他眼部疾病、免疫系统及感染性疾病患者。所有入组者对本研究知情并签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会批准同意。

二、主要仪器和试剂

实时荧光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：7900HT，美国ABI公司)、全自动生化分析仪(型号：BS-220，南京贝登医疗股份有限公司)、RNA提取试剂盒(货号：9767，日本Takara公司)、反转录试剂盒(货号：RR047A，日本Takara公司)、qRT-PCR试剂盒(货号：RR820A，日本Takara公司)。

三、方法

1.样本采集：所有受试者于入组时清晨(7:00～9:00)空腹采集外周静脉血5 ml，经离心后分离上清液，用于常规指标检测。

于玻璃体切除术时收集所有受试者玻璃体和膜组织。于灌注前用玻璃体切割头收集玻璃体组织0.6 ml，于-80 ℃保存备用。术中收集PDR患眼视网膜前增生膜和对照组内界膜组织，于-80 ℃保存备用。

2.玻璃体和膜组织中各因子表达水平检测：采用qRT-PCR法检测玻璃体和膜组织中lncRNA PVT1、miR-26b、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA表达水平。使用RNA提取试剂盒及反转录试剂盒获得cDNA后，用于qRT-PCR实验。qRT-PCR反应体系如下：ROX 0.4 μl ，SYBR®rimix Ex TaqTM10 μl ，上游引物0.8 μl、下游引物0.8 μl，cDNA 2 μl，dH2O 6.0 μl。具体反应步骤如下：95 ℃、33 s，1循环；95 ℃、5 s；62 ℃、38 s，40循环。每个样本重复3次，用2-△△CT法计算lncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表达水平。qRT-PCR所用引物见表1所示，lncRNA PVT1、VEGF以β-actin为内参基因，miR-26b以U6为内参基因。

表1 qRT-PCR引物序列

3.血清常规指标检测：使用全自动生化分析仪检测所有受试者血清糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。

四、统计学分析

结 果

一、两组一般资料比较

PDR组和对照组患者年龄、性别比例、体质指数(BMI)值、血清LDL-C水平、TC水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。PDR组血清FBG、HbA1c水平明显高于对照组，HDL-C水平明显低于对照组(P<0.05)。见表1，2。

表2 两组一般资料比较

二、两组患眼玻璃体中lncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表达水平比较

PDR组患眼玻璃体中lncRNA PVT1、VEGF mRNA表达水平明显高于对照组，miR-26b表达水平明显低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组血清FBG、HDL-C、LDL-C、TG、TC、HbAlc比较

三、两组患眼膜组织中lncRNA PVT1、miR-26b、VEGF mRNA表达水平比较

PDR组患眼膜组织中lncRNA PVT1、VEGF mRNA表达水平明显高于对照组，miR-26b表达水平明显低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 两组患眼玻璃体中lncRNA PVT1、miR-26b表达水平比较

四、PDR组患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1、miR-26b表达水平相关性

PDR组患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1表达水平均与miR-26b表达水平呈负相关(r=-0.424，P=0.001；r=-0.449，P=0.000)。见图1，2。

五、DR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1、miR-26b表达水平与各临床指标相关性

PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1表达水平均与患者血清FBG、HbA1c、VEGF mRNA呈正相关，与患者血清HDL-C呈负相关(P<0.05)。PDR患眼玻璃体和增生膜中miR-26b表达水平均与患者血清FBG、HbA1c、VEGF mRNA呈负相关，与患者血清HDL-C呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 两组患眼增生膜中lncRNA PVT1、miR-26b表达水平比较

表6 PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRN APVT1、miR-26b表达水平与各临床指标相关性

讨 论

PDR发病机制复杂，但视网膜新生血管生成是引发PDR关键因素。探寻与视网膜新生血管生成相关因子对明确PDR发病机理、临床有效控制病情进展有重要意义。

lncRNA是一种长度大于200 nt的非编码RNA，可通过转录、表观遗传学修饰等方式参与人体组织修复、疾病调控等过程。有研究表明，lncRNA可参与DR、脉络膜新生血管、增生性玻璃体视网膜病变等眼部增生性疾病进展[7]。lncRNA PVT1位于人类染色体8q24，可通过参与2、22号染色体间复发性易位，参与细胞凋亡及细胞周期调控[8]。本研究结果显示，PDR组患眼玻璃体和膜组织中lncRNA PVT1表达水平明显高于对照组，提示lncRNA PVT1表达水平升高可能与PDR发生有关。Ma等研究发现，lncRNA PVT1在胶质瘤微血管内皮细胞中高表达，可促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成，为胶质瘤抗血管生成治疗提供了靶点[9]。提示lncRNA PVT1可能通过影响视网膜新生血管生成，参与调控PDR发生发展。有研究证实，lncRNA PVT1过表达可影响VEGF表达水平升高，促进血管生成与胃癌微血管密度增大[10]。VEGF是EMT重要调节因子[11]，Kashiwagi等研究报道，EMT与肿瘤血管重构密切相关[12]。本研究结果显示，VEGF mRNA在PDR组患眼玻璃体和增生膜中表达水平明显升高，且与lncRNA PVT1表达水平呈正相关，提示lncRNA PVT1可能通过调控VEGF介导的EMT进程，促进视网膜新生血管生成，参与PDR进展。

miRNA是一种具有调控功能的短链非编码RNA，能参与疾病发生发展。研究报道，miRNA与PDR发生及患病严重程度有关，具有成为PDR早期检测生物学标志物的潜力[13]。本研究结果发现，PDR组患眼玻璃体和膜组织中miR-26b表达水平明显低于对照组，提示miR-26b水平降低可能对PDR发生有一定作用。miR-26b属于miR-26家族，与血管平滑肌细胞分化、血管生成及心血管修复密切相关[14]。Wang等研究发现，miR-26b在肝细胞癌组织和细胞系中表达水平显著降低，过表达miR-26b可抑制癌细胞成管能力，促使肿瘤微血管密度下降[15]。提示miR-26b对PDR抑制作用可能与视网膜新生血管生成有关。有研究报道，miR-26b可通过调节VEGF抑制癌细胞侵袭和迁移[16]。研究证实，VEGF与EMT调控有关[11]，影响血管生成[17]。Dong等研究表明，人晶状体上皮细胞中miR-26b下调表达促进EMT进展[18]。本研究结果显示，miR-26b与VEGF mRNA表达水平呈正相关，提示本研究中miR-26b下调可能通过影响VEGF水平和EMT，诱导视网膜血管生成，促进PDR发生发展。

Wang等研究发现，lncRNA PVT1在黑色素瘤组织中明显上调，可通过与miR-26b结合，降低miR-26b抑癌作用，促进肿瘤细胞增殖[19]。本研究结果显示，PDR组患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1表达水平均与miR-26b表达水平呈负相关，提示lncRNA PVT1与miR-26b间可能存在相互作用，共同影响PDR进展。

Aryan等研究报道，血清HDL-C水平变化与糖尿病型微血管病变严重程度有关，可作为糖尿病微血管并发症特异性预测因子[20]。Jiang等研究发现，PDR组患者空腹血浆血糖、HbA1c水平明显高于单纯糖尿病组和非增生型DR组[21]。本研究发现，PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1表达水平均与患者血清FBG、HbA1c呈正相关，与患者血清HDL-C呈负相关。PDR患眼玻璃体和增生膜中miR-26b表达水平均与患者血清FBG、HbA1c呈负相关，与患者血清HDL-C呈正相关。进一步提示lncRNA PVT1、miR-26b表达水平异常可能对PDR发生发展有重要影响。

综上所述，PDR患眼玻璃体和增生膜中lncRNA PVT1水平显著升高、miR-26b水平显著降低，与患者血清FBG、HbA1c及HDL-C水平变化有关，二者之间可能存在相互作用，共同影响PDR进展。但由于本研究样本量较少，具体机制还需进一步实验验证。