软骨母细胞瘤样骨肉瘤穿刺标本免疫组化H3F3B、IMP3、Clusterin 联合H3F3B 基因突变检测的意义

徐园园，毛荣军，曾 敏，陈增伟，韩福兰，吴燕杏，谢 乐，黄颖欣

（佛山市中医院病理科，广东 佛山 528000）

软骨母细胞瘤样骨肉瘤（chondroblastoma-like osteosarcoma）与软骨母细胞瘤（chondroblastoma）组织形态学具有相似性，两者间的组织学鉴别要点在于软骨母细胞瘤样骨肉瘤有肿瘤性骨样组织区域，细胞异型性更明显[1-3]。随着骨肿瘤诊治技术及水平的进步，骨肿瘤术前多行穿刺组织病理学活检，穿刺组织的局限性以及骨肿瘤不同区域的异质性均给骨肿瘤的病理学诊断带来不小挑战，当穿刺标本只有软骨母细胞瘤样区域且临床及影像学特点均不明显时，容易误诊为软骨母细胞瘤[2-6]。目前尚未发现软骨母细胞瘤样骨肉瘤有特异且高度敏感的免疫标记物或明确的基因改变，如何鉴别两者仍有待研究。基于此，本研究拟通过免疫组织化学方法联合检测H3F3B、IMP3 及Clusterin 的表达情况，对其中H3F3B 阳性的软骨母细胞瘤样骨肉瘤行H3F3B基因突变检测，探讨其在软骨母细胞瘤样骨肉瘤和软骨母细胞瘤穿刺标本诊断及鉴别诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集佛山市中医院病理科2008 年1 月-2020 年12 月确诊的软骨母细胞瘤样骨肉瘤22 例、软骨母细胞瘤25 例，所有标本均为术前穿刺标本及其对应的手术切除标本，所有病理组织学切片均由两位高年资病理医师复阅，与影像学及临床三结合均诊断意见一致。

1.2 方法 所有标本经10%中性福尔马林固定，需要脱钙处理的部分用温和脱钙液脱钙，常规脱水、透明、石蜡包埋，4～5 μm 连续切片，HE 染色，选取典型病变区域，采用SP 两步法分别进行H3F3B（兔抗人组蛋白H3K36M 单克隆抗体，克隆号RM193，1∶100稀释）、IMP3（胰岛素样生长因子II mRNA 结合蛋白3，即用型）及Clusterin（载脂蛋白J，兔单克隆抗体，克隆号EP181，即用型）免疫组织化学染色，所有抗体及试剂盒均购自上海杰浩生物技术有限公司。对免疫组化H3F3B 阳性的软骨母细胞瘤样骨肉瘤标本行H3F3B 基因突变检测。基因突变检测交由上海生工生物工程公司进行Sanger 测序。

1.3 结果判断 阳性部位：H3F3B：胞核；IMP3：胞质；Clusterin：胞质。阳性判定标准：＞90%中等以上强度着色为（+++），11%～90%中等以上强度着色为（++），1%～10%弱至中等强度着色为（+），＜1%着色为（-）。

2 结果

2.1 临床特点 22 例软骨母细胞瘤样骨肉瘤患者中男15 例，女7 例，年龄14～29 岁，平均年龄21.32岁；影像学19 例均有骨质破坏，其中6 例有软组织肿块并考虑恶性肿瘤，骨肉瘤与软骨肉瘤鉴别；另外3 例倾向软骨母细胞瘤。25 例软骨母细胞瘤患者中男18 例，女7 例，年龄12～21 岁，平均年龄16.24岁；影像学可见膨胀性改变，未见软组织肿块，考虑软骨母细胞瘤，所有病变均位于骨或骨关节。

2.2 免疫组化结果 手术切除标本中，软骨母细胞瘤样骨肉瘤选取软骨母细胞瘤样区域（图1）及肿瘤性骨样组织区域（图2）。免疫组化显示，IMP3 在软骨母细胞瘤样骨肉瘤中的软骨母细胞瘤样区域（图3）及肿瘤性骨样组织区域（图4）均呈弥漫阳性，在软骨母细胞瘤均呈阴性；H3F3B 在软骨母细胞瘤样骨肉瘤中仅1 例的软骨母细胞瘤样区域（图5）呈弥漫阳性，而在肿瘤性骨样组织区域呈阴性；其余21 例软骨母细胞瘤样区域（图6）及肿瘤性骨样组织区域（图7）均呈阴性或散在弱阳性。H3F3B 在25 例软骨母细胞瘤均呈弥漫阳性（图8）。Clusterin 在软骨母细胞瘤样骨肉瘤两种区域及软骨母细胞瘤中均灶状阳性或阴性，见表1。所有病例的多核巨细胞均不表达H3F3B、IMP3 及Clusterin。

表1 IMP3、H3F3B 及Clusterin 在软骨母细胞瘤样骨肉瘤及软骨母细胞瘤中的表达（n）

图1 软骨母细胞瘤样骨肉瘤的软骨母细胞瘤样区域（HE×200）

图2 软骨母细胞瘤样骨肉瘤的肿瘤性骨样组织区域（HE×200）

图3 IMP3 在软骨母细胞瘤样区域弥漫阳性（IHC×200）

图4 IMP3 在肿瘤性骨样组织区域弥漫阳性（IHC×200）

图5 H3F3B 在软骨母细胞瘤样区域弥漫阳性（IHC×200）

图6 H3F3B 在软骨母细胞瘤样区域散在弱阳性（IHC×200）

图7 H3F3B 在肿瘤性骨样组织区域散在弱阳性（IHC×200）

图8 H3F3B 在软骨母细胞瘤弥漫阳性（IHC×200）

2.3 基因突变检测结果 5 例软骨母细胞瘤样骨肉瘤免疫组化H3F3B 有强弱不等的阳性，行H3F3B 基因突变检测，均为阴性。

3 讨论

软骨母细胞瘤样骨肉瘤是普通型骨肉瘤的一种亚型，其发生部位、年龄、影像学特征符合骨肉瘤的特点，组织形态学具有软骨母细胞瘤的部分特征，但其部分区域可观察到肿瘤性骨样组织，并有髓内浸润、骨皮质侵蚀及软组织肿块的特点，可与软骨母细胞瘤鉴别。部分病例临床及影像学特点均不典型，即使在大标本中有时也很难找到典型的肿瘤性骨样组织区域，术前穿刺组织病理学活检常常只能观察到软骨母细胞瘤样区域，容易误诊为软骨母细胞瘤[7-9]。

软骨母细胞瘤的治疗方法以病灶切除为主；软骨母细胞瘤样骨肉瘤是恶性肿瘤，治疗方法以手术切除及术前术后化疗为主。骨肉瘤以往单纯手术切除的5 年生存率在10%～20%，而临床可切除的骨肉瘤联合术前术后化疗的5 年生存率＞50%，化疗可以明显改善患者的预后，接受了术前化疗且有良好效应的患者有可能实行保肢手术。骨肉瘤误诊或者漏诊，可导致患者失去接受系统治疗的机会，生存率大大降低。

既往的研究发现，IMP3 在胃癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌、涎腺粘液表皮样癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、子宫内膜癌、骨肉瘤、黑色素瘤、间皮瘤、前列腺癌等多种恶性肿瘤组织中有表达[10-13]，与肿瘤细胞的增殖及转移密切相关，可通过上调IGF-II 蛋白的表达水平导致肿瘤细胞增生，通过调节多种细胞黏附因子使肿瘤细胞黏附，形成树突状伪足，产生侵袭作用[14-16]。本组实验中，IMP3 在22 例软骨母细胞瘤样骨肉瘤两种区域均弥漫阳性，在25 例软骨母细胞瘤均阴性，IMP3 弥漫阳性支持软骨母细胞瘤样骨肉瘤的诊断。

人组蛋白H3.3 的变体包括H3F3A（定位于1q42.12）及H3F3B（定位于17q25.1）两个编码基因，表达于细胞周期任何阶段，在活性基因启动子区、增强子区和内部调节区等取代H3.1/H3.2[17]，通过表观调节影响基因的表达，主要参与细胞增殖、分化、减数分裂等多个生物学过程[18]。既往文献报道H3F3B是软骨母细胞瘤敏感且特异的诊断标记物[19]，在软骨肉瘤中阴性表达[20]；约90%的软骨母细胞瘤具有H3F3B 基因突变，尚未发现骨肉瘤具有特殊的基因改变。本研究22 例软骨母细胞瘤样骨肉瘤中，18 例的H3F3B 均阴性，3 例散在弱阳性，仅1 例的软骨母细胞瘤样区域弥漫强阳性，但在肿瘤性骨样组织区域阴性，提示肿瘤不同区域存在异质性，容易误诊；而这些有阳性区域的病例未检测出H3F3B 基因突变，提示免疫组化与基因检测缺乏一致性。22 例中有3 例的影像学倾向软骨母细胞瘤的诊断，穿刺标本中有5 例仅见软骨母细胞瘤样区域，给诊断带来更大难度。

Clusterin 是一种存在于多种细胞组分中具有多种存在形式、功能复杂多样的蛋白，参与细胞内外重要的生命活动，与神经退行性疾病、免疫疾病、衰老、肿瘤等在内的许多疾病相关[21]。本研究显示，Clusterin 在软骨母细胞瘤样骨肉瘤及软骨母细胞瘤中均呈灶状阳性或阴性，诊断应用价值不大。

综上所述，软骨母细胞瘤样骨肉瘤及软骨母细胞瘤组织形态学上有相似性，穿刺标本中不易区分，对不典型的病例，单凭形态学诊断容易误诊，联合检测免疫组化IMP3 及H3F3B 对明确诊断有较大指导意义。在结合临床、影像及病理形态学特点的基础上，H3F3B 阴性、IMP3 弥漫阳性支持软骨母细胞瘤样骨肉瘤的诊断，H3F3B 弥漫阳性、IMP3 阴性支持软骨母细胞瘤的诊断，H3F3B 阳性、IMP3 弥漫阳性更倾向于软骨母细胞瘤样骨肉瘤的诊断，即使在未检见肿瘤性骨样组织的穿刺标本，H3F3B 阴性、IMP3 弥漫阳性时仍高度倾向软骨母细胞瘤样骨肉瘤的诊断，需结合临床及影像学，避免误诊漏诊。另外，病理诊断中需充分取材，寻找有无肿瘤性成骨，并结合临床及影像学鉴别软骨母细胞瘤与软骨母细胞瘤样骨肉瘤。