麝香保心丸下调代谢综合征大鼠心肌组织尾加压素Ⅱ及其受体表达的实验研究

廖丛娟，张旭升， 黄战军， 樊小容，谭小青，蔡博治

代谢综合征(MS)包括高血压和血脂、血糖及尿酸代谢异常等临床表现，作为与心血管系统疾病密切相关的多种危险因素，可损伤血管内皮功能、促进动脉粥样硬化、细胞增殖及胶原沉积等病理过程，最终引起心肌及血管重构发生[1]。MS诱导心肌重构的机制相当复杂，研究发现高血压导致血流高剪切力、血脂和尿酸代谢异常及胰岛素抵抗等作用扮演了重要角色。心肌局部炎症反应、氧化应激及脂肪细胞因子等活性因子的作用均参与了心肌重构等过程，而血管活性多肽的生物学效应也越来越受到关注[2-4]。尾加压素Ⅱ(UⅡ)是一种类生长抑制素的血管活性多肽， UⅡ特异受体(UT)为GRP14，属G蛋白耦联受体，两者在心血管组织中均有表达，UⅡ通过结合UT而发挥强烈收缩血管、促进胶原沉积、心肌细胞增殖及血管钙化等生物学效应[5-6]。因此，防治MS诱导的心肌重构除了控制相应的危险因素，还需要应用针对其分子机制的药物，麝香保心丸具有抑制炎症反应及抑制细胞凋亡等作用[7]，本课题组早期研究发现，麝香保心丸可抑制MS诱导的心肌重构[8]，但分子机制未进一步探讨，为此，本实验观察麝香保心丸对MS大鼠模型心肌重构的变化，同时观察心肌组织UⅡ/UT表达的变化，探讨麝香保心丸的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品及仪器设备 实验动物为8周龄雄性SD大鼠。鼠尾动脉测压仪由汕头大学医学院实验动物中心提供，高果糖饲料(60%)由北京华阜康生物科技有限公司配制提供；Beckman Coulter AU5800生化仪购自美国，由汕头大学医学院第一附属医院检验科提供；血糖试纸及快速血糖仪购自美国雅培；UⅡ放射免疫试剂盒由北京华英生物研究所提供；UT一抗(多克隆)购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗购自武汉博士德公司；麝香保心丸购自上海和黄药业有限公司。

1.2 MS大鼠模型建立及分组 取雄性SD大鼠24只，先随机分成正常对照组(8只)和MS组(16只)，分别用普通饲料和高果糖饲料喂养，8周后检测大鼠空腹血糖、血清三酰甘油浓度和尾动脉压，以确定MS模型建立成功。然后再将MS组大鼠随机分成模型对照组(8只)和麝香保心丸组(8只)， 麝香保心丸组予麝香保心丸25 mg/kg灌胃，每天1次。两组均继续高果糖饲料喂养，饲养4周。

1.3 标本收集及处理 3组大鼠均禁食、禁水8 h以上，常规称重麻醉，剪开胸腔暴露心脏取血，取一部分血置于普通试管，静置凝固析出血清；一部分血置于含有EDTA和抑肽酶的试管中，低温离心分离血浆，-80 ℃保存。摘取心脏，称重后切取部分心肌组织，4%多聚甲醛固定，制作蜡块，用锡纸包裹其余心肌组织，于-80 ℃保存。

1.4 大鼠空腹血糖、血清三酰甘油和尾动脉压测定 采用快速血糖仪检测血糖；采用Beckman Coulter AU5800生化仪检测血清三酰甘油浓度；采用鼠尾动脉测压仪测量血压。

1.5 心肌肥厚指数测定和心肌组织Masson染色 心肌肥厚指数=心脏重量/体重；取大鼠心肌组织蜡块，制作4 μm厚切片，脱蜡、水化、脱水，滴入Masson复合染色液进行染色(按照说明书操作)，脱水、透明、封片，在光镜下观察。

1.6 大鼠血浆和心肌组织UⅡ含量测定 采用放射免疫法测定UⅡ含量，具体步骤按试剂盒说明书操作。

1.7 心肌组织UT表达测定 制作切片，脱蜡入水，5%胎牛血清封闭非特异性抗原，滴加UT一抗(浓度1∶200)过夜，滴加二抗，DAB显色，具体步骤按说明书进行。

2 结 果

2.1 大鼠MS模型的特点 与正常对照组相比，MS组大鼠血糖、三酰甘油和尾动脉平均压水平均明显升高(P<0.01)。详见表1。

表1 两组空腹血糖、三酰甘油和尾动脉平均压水平比较(±s)

2.2 心肌组织胶原染色对比 MS大鼠心肌组织心肌细胞排列紊乱，细胞间质可见明显胶原沉积，心脏肥厚指数较正常组明显增加。详见图1。

图1 大鼠心肌组织Masson染色(×40)(蓝色为胶原成分)

2.3 大鼠血浆和心肌组织UⅡ含量变化 与正常对照组相比，模型对照组大鼠血浆UⅡ含量差异无统计学意义，心肌组织UⅡ含量、心脏肥厚指数明显增加，用麝香保心丸干预后，心肌组织中UⅡ含量、心脏肥厚指数有所下降(P<0.01)。详见表2。

表2 各组大鼠血浆、心肌组织UⅡ含量和心脏肥厚指数比较(±s)

2.4 大鼠心肌组织UT的表达 MS大鼠心肌组织UT表达明显上调，用麝香保心丸干预后，UT表达有所下调。详见图2。

图2 大鼠心肌组织UT免疫组化染色(×100)(棕黄色为阳性表达)

3 讨 论

MS包括高血压、尿酸及糖脂代谢异常等多种心血管危险因素，这些均可导致血管损伤、细胞增殖、胶原沉积及心肌肥厚等作用，最终导致心血管重构的发生，病理表现在平滑肌细胞、心肌细胞及心肌成纤维细胞等增殖明显、细胞排列结构紊乱、细胞间质胶原明显沉积等，主要分子机制包括血管活性因子作用、炎症反应、脂肪因子效应及氧化应激作用等[1-2，9]。而肥胖是导致MS的重要因素，近年来因生活方式的改变，肥胖人群明显增多，导致MS发病率升高，因此，防治MS诱导的心肌重构已成为主要治疗目标。

本实验结果显示，高果糖饲料饲养大鼠8周后可诱导具有典型MS特征的大鼠模型，并且MS大鼠心肌组织出现心肌细胞增殖、排列紊乱，胶原蛋白明显沉积等，心脏肥厚指数较正常对照组大鼠明显增加，提示大鼠心肌发生重构，与其他学者研究结果[4]一致。进一步研究发现MS大鼠心肌组织UⅡ/UT表达明显增加，与心肌重构的程度相关，而3组大鼠血浆UⅡ水平比较差异无统计学意义，提示UⅡ/UT可能通过自分旁分泌的方式参与了MS大鼠心肌重构的过程。

UⅡ是近些年来发现的最强血管收缩物质，UⅡ主要分布在心血管组织、神经组织及内分泌系统，研究发现UⅡ/UT 系统在心血管上的效应主要是引起细胞增殖、迁移，促进心肌细胞胶原蛋白合成，加重心血管重构的发生与发展，与钙离子、钙调素、蛋白激酶C、丝裂素活化蛋白激酶及ERK/NF-κB等信号转导通路相关[10-12]。本研究发现UⅡ/UT在正常生理状态下在心血管组织的表达很少，但在高血压、高脂血症及胰岛素抵抗等病理状态的刺激和诱导下，UⅡ在心血管组织局部大量表达，同时UT表达上调并与UⅡ结合，从而发挥其促心肌细胞增殖、胶原蛋白沉积等生物学效应，结合外周血液UⅡ表达，但差异无统计学意义，考虑UⅡ/UT以自分泌/旁分泌的方式发挥作用可能性较大。

有研究发现，麝香保心丸具有保护血管内皮功能、稳定动脉粥样硬化斑块、抑制炎症反应及血管钙化[13-15]等作用。本实验用麝香保心丸干预后，MS大鼠心肌组织UⅡ和UT表达明显下降，同时心肌组织胶原沉积和心脏肥厚指数有所减轻，提示麝香保心丸可抑制UⅡ/UT表达，改善心肌重构，可能是改善心肌重构的重要分子机制之一，这将为心肌重构的机制研究及防治提供新的思路和作用靶点。