蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中氧化三甲胺高温热分解的影响

李颖畅 杜凤霞 张 笑 刘雪飞 蔡友琼 杨贤庆 励建荣*

（1 渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁锦州121013 2 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海200090 3 中国水产科学研究院南海水产研究所 广州540641）

近年来，从鱿鱼、鱿鱼制品以及其它水产品中检测出甲醛（formaldehyde，FA）[1]，引起人们的关注，认为水产品自身能够产生甲醛[2]。 水产品在高温作用下体内的氧化三甲胺 （trimethylamine oxide，TMAO）热分解为三甲胺（trimethylamine，TMA）、二 甲 胺（dimethylamine，DMA）和 甲 醛[3-4]。Lin 等[5]研究发现200 ℃条件下加热反应1 h 后鱿鱼肌肉组织中大部分氧化三甲胺发生热分解反应。 生物体内的还原性的小分子物质对氧化三甲胺分解形成甲醛具有催化作用。 Ferris 等[6]证实了氧化三甲胺在Fe2+催化下能够生成甲醛和二甲胺。 Vaisey[7]研究证明了半胱氨酸（Cys）与Fe2+或Cys 与血红蛋白能催化氧化三甲胺分解产生三甲胺、少量二甲胺和甲醛。 Spinelli 等[8]发现抗坏血酸和Fe2＋等对鱿鱼体内氧化三胺热分解有促进作用。李丰等[9]研究发现乳糖可以促进模拟体系中氧化三甲胺的分解。 陈帅等[10]认为半乳糖对氧化三甲胺的热分解有促进作用。 氧化三甲胺热分解产生甲醛严重制约鱿鱼加工产业的发展， 采取有效措施抑制甲醛的产生， 是一项重要的研究任务。Zhu 等[11]和励建荣等[12]研究表明秘鲁鱿鱼热加工过程中有甲醛和自由基形成。朱军莉等[13-14]研究发现添加柠檬酸和氯化钙会显著降低（P＜0.05）鱿鱼提取物中氧化三甲胺的热分解， 同时柠檬酸根离子对鱿鱼提取物中DMA 和FA 的形成也有负面影响。 蓝莓多酚类化合物是蓝莓叶中的一种重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、保护视力、抑制微生物生长、 降血脂、 降血糖等多种功能特性[15]。 蓝莓叶多酚对鱿鱼中氧化三甲胺热分解的影响鲜见报道。本文以鱿鱼上清液为对象，分析蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中氧化三甲胺高温分解的影响， 以及对秘鲁鱿鱼高温加热过程中甲醛的抑制作用，为寻找天然、高效的甲醛抑制剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

蓝莓叶， 沈阳农业科学发展研究院； 秘鲁鱿鱼，锦州市林西路水产市场。

三羟甲基氨基甲烷（Tris），天津市百世化工有限公司；甲醛溶液，邹平恒坤化工有限公司；石油醚，郑州易兴化工产品销售有限公司；2，4-二硝基苯肼，上海邦成化工有限公司；无水乙醇，扬州德诺化工有限公司；氢氧化钠，山西天河化工有限公司；苦味酸，国药集团化学试剂有限公司；三氯化钛（TiC13），广州顺平生物科技有限公司；对甲苯磺酞氯，吴江市博霖实业有限公司；乙酸，上海迈瑞尔化学技术有限公司；甲苯，天津市密欧化学试剂有限公司；2-苯叔丁基硝酮（PBN），北京百灵威生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯级。甲醛标准溶液、氧化三甲胺标准品，国家环境保护总局标准样品研究所； 甲醇（色谱纯）， TEDIA 公司；AB-8 大孔树脂，天津市津达正通环保科技有限公司。

1.2 设备与仪器

CF1524R 冷冻高速离心机， 美国赛洛捷克（scilogex）公司； AD500S-P 高速分散均质机，苏州江东精密仪器有限公司；JR10-300 绞肉机，浙江苏泊尔股份有限公司；166457 旋转蒸发仪，北京鼎盛兄弟科技有限公司；BSH-3A 循环水真空泵，信凯（北京）科技有限公司；Series Ⅱ型高压输液泵、恒流泵，北京中教金源科技有限公司；SDY-2 恒温水浴锅，北京赛欧华创科技有限公司；Free-Zone 2.5 L 台式冻干机， 美国Labconco 公司；HPLC1200 高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；UV1700PC 紫外-可见分光光度计， 上海奥析科学仪器有限公司；PX2202ZH 电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；安捷伦7890 气相色谱仪， 美国安捷伦科技有限公司；SB25-12DT 超声波，宁波SCIENTZ/新芝公司；电子自旋共振仪，德国Magnettech 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓叶多酚的制备 参照李颖畅等[16]的方法。

1.3.2 鱿鱼上清液的制备 10 g 秘鲁鱿鱼，去皮、骨、内脏，绞碎。 取碎鱿鱼肉，按1∶2（g/mL）与20 mmol/L Tris-乙酸缓冲液（pH 7.0）混合，匀浆，冰浴条件下超声30 min， 离心15 min （12 000 r/min），取上清液，4 ℃冷藏备用。

1.3.3 蓝莓叶多酚浓度对鱿鱼上清液TMAO 高温热分解的影响 分别取质量浓度为0，1，5，10，50，100，150，200 mg/L 的蓝莓叶多酚溶液2 mL，与2 mL 鱿鱼上清液混合，反应温度90 ℃，在反应时间15 min 条件下反应。 测定鱿鱼上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量的变化。

1.3.4 加热时间对鱿鱼上清液TMAO 高温热分解的影响 取0.05 g/L 蓝莓叶多酚溶液2 mL 与2 mL 鱿鱼上清液混合，在反应温度90 ℃，加热时间分别为0，15，30，45，60，75，90 min 条件下反应。测定鱿鱼上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量的变化。

1.3.5 反应温度对鱿鱼上清液TMAO 高温热分解的影响 取0.05 g/L 蓝莓叶多酚溶液2 mL 与2 mL 鱿鱼上清液混合，在反应时间15 min，反应温度分别为80，90，100，110，120，130 ℃。 测定鱿鱼上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量变化。

1.3.6 蓝莓叶多酚抑制甲醛产生的自由基机制在0.25 mL 鱿鱼上清中分别添加不同质量浓度（0，0.005，0.05，0.1 g/L）的蓝莓叶多酚溶液0.25 mL， 添加2-苯叔丁基硝酮后在100 ℃加热15 min，以蒸馏水代替蓝莓叶多酚作对照，检测自由基的变化。

1.3.7 甲醛、二甲胺、三甲胺和氧化三甲胺的检测方法 甲醛含量测定参考Li 等[17]的方法；二甲胺含量测定参考贾佳等[18]的方法；三甲胺含量测定参考朱军莉等[19]的方法；氧化三甲胺含量测定：量取4 mL 反应液，加入0.5 mL 1% TiCl3溶液，80 ℃水浴90 s，流水冷却，测定步骤与三甲胺的相同。

1.3.8 自由基的检测方法 根据贾佳等[20]的方法。

1.4 数据处理

所有试验每组取3 个平行，结果为均值±标准偏差。 采用SPSS19.0 的ANOVA 进行方差分析，P＜0.05 为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同浓度蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液高温热分解的影响

Zhu 等[11]研究发现氧化三甲胺（TMAO）在高温热分解过程中能够产生二甲胺和甲醛。 由图1可知， 未加蓝莓叶多酚的鱿鱼上清液中甲醛含量是最高的。随着蓝莓叶多酚浓度的增加，上清液中FA、DMA 和TMA 的含量不断减少， 分别从1.53，49.49，46.07 mg/L 降 至0.14，41.42 mg/L 和33.29 mg/L；而TMAO 含量的变化却相反，随蓝莓叶多酚浓度的增加，TMAO 含量增加，分解量减少，其含量从2027.47 mg/L 升至2 533.90 mg/L。 蓝莓叶多酚质量浓度在50～100 mg/L 之间，FA 的生成量和TMAO 的减少量无显著性差异（P＞0.05），蓝莓叶多酚质量浓度为50 mg/L 时， 甲醛的减少量和TMAO 的生成量趋于平衡。 蓝莓叶多酚溶液对鱿鱼上清液TMAO 的热分解反应有抑制作用， 可显著降低鱿鱼上清液中甲醛含量， 当蓝莓叶多酚质量浓度≥50 mg/L 时抑制效果较好。 Garro Galvez等[21]报道没食子酸能够和甲醛反应，与本研究结果一致。 Ferris 等[22]研究发现TMAO 在Fe2+的催化下通过（CH3）3N 自由基生成FA、DMA 和TMA。蓝莓叶多酚能够抑制TMAO 的分解和FA 的生成，其原因可能是蓝莓叶多酚中的单宁酸类物质与Fe2+生成某种物质抑制了自由基生成，从而导致上清液中TMAO 的分解受到抑制， 或者蓝莓叶多酚可能与FA 发生酚醛反应使FA 的最终含量减少，达到抑制效果。

图1 蓝莓叶多酚质量浓度对鱿鱼上清液氧化三甲胺高温热分解的影响Fig.1 Effects of polyphenols concentration of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant

2.2 加热时间对鱿鱼上清液高温热分解的影响

不同加热时间下蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中TMAO 热分解的影响如图2 所示。Zhu 等[11]报道随着加热时间的增加，TMAO 热分解成甲醛和二甲胺加速。 对照组和蓝莓叶多酚处理组TMAO 含量降低，90 min 内对照组鱿鱼上清液中TMAO 含量从2 327.03 mg/L 减至1 230.21 mg/L，氧化三甲胺含量减少了47.13%。 与对照组相比，添加0.05 g/L蓝莓叶多酚的鱿鱼上清液90 min 内TMAO 的含量从2 336.04 mg/L 减至2 106.46 mg/L，氧化三甲胺含量减少了9.83%，TMAO 含量的减少被显著抑制。 对照组鱿鱼上清液中FA、DMA 和TMA 的含量随着加热时间的增加而增加， 分别从0.19，47.10 mg/L 和18.35 mg/L 升 至11.49，104.50 mg/L和51.03 mg/L。 与对照组相比，蓝莓叶多酚组鱿鱼上清液中FA、DMA 和TMA 含量的增加被抑制，加热90 min 后FA 含量仅0.86 mg/L， 说明蓝莓叶多酚使鱿鱼上清液中甲醛含量降低， 其原因是蓝莓叶多酚与FA 发生酚醛缩合反应，导致FA 含量减少。 蓝莓叶多酚有可能抑制鱿鱼上清液中TMAO 高温热分解， 导致DMA、TMA 和FA 含量降低。

2.3 反应温度对鱿鱼上清液高温热分解的影响

图2 不同加热时间的蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中TMAO 热分解的影响Fig.2 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different time

不同加热温度下蓝莓叶多酚对TMAO 热分解的影响如图3 所示。随着加热温度的增加，对照组和蓝莓叶多酚处理组氧化三甲胺含量均降低，温度越高降低越显著， 而对照组鱿鱼上清液中氧化三甲胺含量显著低于（P＜0.05）蓝莓叶多酚组鱿鱼上清液中氧化三甲胺含量， 即蓝莓叶多酚使氧化三甲胺热分解程度降低。随着加热温度的升高，对照组鱿鱼上清液中氧化三甲胺含量从2 179.871 mg/L 降至1 519.392 mg/L，氧化三甲胺含量下降了30.29%。 蓝莓叶多酚处理的鱿鱼上清液中TMAO含量从2 356.466 mg/L 降至2 048.813 mg/L，氧化三甲胺含量下降了13.06%。 随着加热温度的升高，对照组甲醛含量显著（P＜0.05）增加，而蓝莓叶多酚处理组甲醛含量增加缓慢。 随着加热温度的升高， 对照组鱿鱼上清液中甲醛含量从0.663 mg/L 增至6.541 mg/L， 对照组甲醛含量增加了9.77倍。 蓝莓叶多酚组鱿鱼上清液FA 的最高含量达0.560 mg/L，说明加热温度越高，产生的甲醛越多，在蓝莓叶多酚的作用下， 不同加热温度的鱿鱼上清液中甲醛含量降低。 对照组和蓝莓叶多酚处理组二甲胺和三甲胺含量随着加热温度的升高也显著（P＜0.05）上升，而蓝莓叶多酚处理组二甲胺和三甲胺含量显著（P＜0.05）低于对照组。 对照组的三甲胺和二甲胺最高含量分别为57.714，58.597 mg/L。 蓝莓叶多酚处理组三甲胺和二甲胺最高含量分别为49.465，47.527 mg/L。 添加蓝莓叶多酚后，三甲胺含量降低了14.29%，二甲胺含量降低了18.89%。 在蓝莓叶多酚的作用下，鱿鱼上清液中氧化三甲胺高温热分解被抑制， 导致上清液中三甲胺和二甲胺含量下降。

图3 不同加热温度的蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中TMAO 热分解的影响Fig.3 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different temperature

2.4 不同pH 值蓝莓叶多酚溶液对鱿鱼上清液高温TMAO 热分解的影响

不同pH 值蓝莓叶多酚溶液对鱿鱼上清液中TMAO 热分解的影响如图4 所示。pH＜7 时对照组和蓝莓叶多酚组鱿鱼上清液中TMAO 含量随pH值的升高而降低， pH＞7 时对照组和蓝莓叶多酚组鱿鱼上清液中TMAO 含量升高。与对照组相比，用蓝莓叶多酚处理的鱿鱼上清液TMAO 含量显著（P＜0.05）高于对照组鱿鱼上清液中TMAO 含量，说明蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中TMAO 高温热分解有抑制作用。pH＜7 时对照组和蓝莓叶多酚组鱿鱼上清液中FA、DMA 和TMA 含量随pH 值的升高而升高；pH＞7 时对照组和蓝莓叶多酚组鱿鱼上清液中FA、DMA 和TMA 含量降低。 与对照组相比， 蓝莓叶多酚处理组的鱿鱼上清液中FA 含量显著（P＜0.05）降低。 TMAO 高温热分解与pH 值有关，pH7.0 时TMAO 热分解的量最少，产生甲醛的量也最少。

图4 不同pH 值的蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中TMAO 热分解的影响Fig.4 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different pH

2.5 蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液TMAO 热分解产生自由基的影响

图5 不同浓度蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中自由基的影响Fig.5 Effects of different concentration polyphenols of blueberry leaves on the generation of free radical in squid supernatant

以PBN 为自由基捕获剂，利用ESR 技术检测不同浓度蓝莓叶多酚与鱿鱼上清液反应样品中的自由基。 如图5 所示， 在磁场3 460.00～3 560.00 G，对照组的鱿鱼上清液经高温处理产生明显的六重峰自由基信号，在添加质量浓度为0.005 g/L 和0.05 g/L 的蓝莓叶多酚的鱿鱼上清液中也出现明显的六重峰自由基信号， 而自由基信号强度要比对照组弱。励建荣等[12]和李颖畅等[23]在鱿鱼上清液中也捕捉到相同的自由基信号， 并发现鱿鱼中甲醛的产生与自由基存在密切的关系。 从图5 可以看出，随着蓝莓叶多酚浓度的增加，鱿鱼上清液中自由基信号强度逐渐减弱， 当蓝莓叶多酚质量浓度达到0.1 g/L 时，鱿鱼上清液中的自由基信号为基线杂峰。 蓝莓叶多酚对自由基信号强度的影响与蓝莓叶多酚抑制甲醛的产生是一致的。 由此可知， 蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液高温热分解途径的抑制作用， 可能与蓝莓叶多酚能够清除鱿鱼上清液中自由基有关。

3 结论

1）不同浓度的蓝莓叶多酚抑制鱿鱼上清液中氧化三甲胺的热分解，使鱿鱼上清液中三甲胺、二甲胺和甲醛含量降低，蓝莓叶多酚浓度越大，抑制效果越显著。 加热时间对氧化三甲胺热分解影响显著。 不同加热时间的蓝莓叶多酚处理组的氧化三胺含量高于对照组，甲醛、二甲胺和三甲胺含量低于对照组。 加热温度对鱿鱼上清液中氧化三胺热分解影响极显著，当温度90～130 ℃时氧化三甲胺热分解增强， 产生大量三甲胺、 二甲胺和甲醛。 蓝莓叶多酚可抑制不同加热温度下氧化三甲胺的分解，三甲胺、二甲胺和甲醛含量显著低于对照组。

2）鱿鱼上清液加热过程中产生自由基。加入蓝莓叶多酚后， 鱿鱼上清液中自由基信号强度减弱，蓝莓叶多酚浓度越高，鱿鱼上清液中自由基信号强度越弱。