壳聚糖分子质量对原位改性纳米CaCO3-壳聚糖涂膜食品保鲜性能的影响

王 明 郝文婷 杨丽丽 张 璇 韩 英 孙 彤* 谢 晶 励建荣

（1 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州121013 2 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省食品安全重点实验室 辽宁锦州121013 3 河北省衡水市武邑县委宣传部 河北衡水053400 4 上海海洋大学食品学院 上海201306）

甲壳质（Chitin）又称甲壳素、几丁质，具有生物降解性、 低免疫原性、 无毒和生物相容性等优点， 是仅次于纤维素的第二大类生物高分子聚合物[1]。甲壳质及其衍生物日益成为很受欢迎的生物材料。 壳聚糖[（C6H11NO4）n]是甲壳质（C8H13NO5）的脱乙酰产物， 是一种含有多个单体的阳离子聚合物，不仅易生物降解，无毒副作用，而且具有较好的成膜性、生物相容性、润湿性、保湿性和可食用性。 此外，壳聚糖是带有正电荷的聚合阳离子，作为一种抗菌物质广泛应用于食品工业领域[2-3]。 有研究表明，壳聚糖涂膜液已应用于槟榔[4]、丝瓜[5]、鲶鱼[6]和大黄鱼[7]等食物保鲜中，它的保鲜效果显著优于其它保鲜方式。 单一壳聚糖涂膜的机械强度较差、透水率大、溶解性差且韧性不够[8-9]。 在壳聚糖等聚合物材质中添加纳米蒙脱土[10]、纳米氧化锌[11]、纳米银[12]和纳米二氧化钛[13]等粒子，可显著提高复合涂膜的稳定性，控制气体透过性，提高抑菌杀菌性和抗氧化性， 进而提高食品保鲜性能[14]。 RAMEZANI 等[15]研究表明，与单一壳聚糖涂膜相比，纳米三聚磷酸钠-壳聚糖复合涂膜的致密性更好，抗菌性能更优，对银鲤鱼片的保鲜效果更好。

纳米CaCO3是食品保鲜材料中应用广泛的无机纳米材料之一，因其无毒害，来源途径多，且制作成本低廉，而被广泛应用于保鲜材料中[16]。 徐晓玲等[17]研究指出，纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜显著延长了鲜切山药和枇杷的货架期， 且其保鲜效果优于未改性壳聚糖涂膜。然而，纳米CaCO3自身粒径小，表面能较大，团聚现象明显，导致该材料在复合涂膜中分散性较差。 为了增加纳米CaCO3与其它聚合物界面的表面结合力， 提高分子的分散能力，需对纳米CaCO3进行表面改性。主要通过降低分子粒子表面的能态， 消除物质表面电荷作用， 提高纳米粒子间有机相的亲和力以及减弱其粒子的表面极性等方式降低纳米CaCO3粒子的易团聚现象，从而提高高聚物制品的物理性能[18]。

壳聚糖的分子质量从数十万至数百万不等，且分子质量是影响其物化性质及功用的重要因素之一。 如低分子质量的壳聚糖表现出较好的抗菌活性，在植物调节剂、抑菌剂和食品防腐剂等应用方面具有得天独厚的优势[19-21]。为了获得保鲜性能优良的原位改性纳米CaCO3-壳聚糖涂膜，本文研究壳聚糖分子质量对纳米CaCO3复合涂膜理化性能的影响，并以美国红鱼为保鲜对象，测定其保鲜性能， 以期为壳聚糖复合保鲜涂膜的深入研究提供重要参考，为其应用推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活美国红鱼，购自辽宁省锦州市水产市场。壳聚糖（脱乙酰度≥95%，食品级），上海晶纯试剂有限公司；营养琼脂、LB 肉汤，北京奥博星生物试剂有限公司；硅油，国药集团化学试剂有限公司；酚酞，天津市风船化学试剂科技有限公司；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

S-4800 型场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；Jem-2100F 型场发射透射电子显微镜，日本电子株式会社；Scimitar 2000 Near FT-IR Spectrometer 型傅里叶变换红外光谱仪，美国安捷伦公司；Rigaku Ultima IV 型X 射线粉末衍射仪，日本理学；TA-XT-PLUS 型质构仪， 英国Stable Micro Systems 公司；FA2104C 型电子天平， 上海越平科学仪器有限公司；CYES-Ⅱ型O2/CO2气体测定仪，上海嘉定学联实业有限公司；UV-2550 型紫外-可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；FE20型pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HPLC1200 型高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；LZB-3 型转子流量计， 南京隆顺仪器仪表有限公司；CJJ79-1 型磁力加热搅拌器， 山东鄄城威瑞科教仪器有限公司；SK6210HP 型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；DGG-9053AD 型电热鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；T25 型数显型均质机， 上海珂淮仪器有限公司；MLS-3030CH 型立式高压蒸汽灭菌锅，日本三洋电机有限公司；THZ-D 型台式恒温振荡箱， 太仓市实验设备厂；LRH-150 型生化培养箱， 上海恒科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合保鲜涂膜的制备 参照韩英等[22]的方法制备原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合保鲜涂膜。

1.3.2 原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合保鲜涂膜的表征分析 采用场发射扫描电子显微镜观察涂膜断面的微观形貌； 采用场发射透射电子显微镜观察染色切片处理后涂膜内纳米粒子的分布状态； 采用傅里叶变换红外光谱仪测定涂膜的FTIR 光谱（KBr 压片法，波数范围为4 000～400 cm-1）；采用X 射线粉末衍射仪对涂膜进行X 射线衍射分析（40 kV，50 mA，CuKα 辐射，步宽0.02°，扫描范围5°～70°）。

1.3.3 原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合保鲜涂膜理化性能测定

1）参照韩英等[22]的方法并做适当修改。 采用质构仪测量涂膜的拉伸强度 （Ts）和断裂伸长率（EB），测试条件：夹距40 mm，测试前速度10 mm/s，测试中速度2 mm/s。

2）参照郝文婷等[23]的方法，采用失重法测量涂膜的水蒸气透过量（WVTR）。

3）参照GB/T 1038-2000 《塑料薄膜和薄片气体透过性试验方法 压差法》，采用O2/CO2气体测定仪测定CO2和O2浓度， 计算CO2透过率（CDP）和O2透过率（OP）。

4）参照韩英等[22]的方法测定原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合保鲜涂膜的透光率。

1.3.4 美国红鱼保鲜性能测定 美国红鱼样品处理参照孙彤等[24]的方法。 分别测定不同贮藏时间美国红鱼的各项性能指标。

1）参照MANJU 等[25]的方法稍做修改。 5 人组成感官评分小组， 对美国红鱼进行感官性质评分。

2）参照王明等[26]的方法测定样品pH 值。 称取5.00 g 绞碎的鱼肉，加入50 mL 蒸馏水，均质，静置，过滤，并测定滤液pH 值。

3）参照于林等[27]的方法测定美国红鱼样品菌落总数。 取10.00 g 鱼肉，加入90 mL 无菌生理盐水，拍打，均质，静置，稀释，并进行微生物培养和计数测定。

4）参照孙彤等[24]和李颖畅等[28]的方法测定并计算美国红鱼样品的TBA 值。

5）参照GB 5009. 228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮》，测定美国红鱼TVBN。

6）参照CHENG 等[29]的方法处理，测定并计算美国红鱼样品的K 值。

式中，HxR——次黄嘌呤核苷的质量摩尔浓度，μmol/g；HxR、Hx、ATP、ADP、AMP 和IMP 分别为次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸和肌苷酸的质量摩尔浓度，μmol/g。

7）参照王明等[26]的方法处理并测定美国红鱼样品的质构指标。

以上测定指标均做3 次平行试验， 测定结果以“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖分子质量对原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合保鲜涂膜微结构的影响

2.1.1 不同分子质量壳聚糖的原位改性纳米Ca-CO3-壳聚糖复合保鲜涂膜的微观形貌 不同分子质量壳聚糖涂膜液中加入原位改性纳米CaCO3制备的复合涂膜，断面微观形貌如图1 所示。壳聚糖分子质量为60 kU 时，涂膜断面平整光滑。 壳聚糖分子质量为100 kU 时，涂膜断面不平整，有较多裂纹和宽度约100 nm 的气孔。分子质量增至160 kU 时，涂膜断面的裂纹和气孔减少。 当壳聚糖分子质量为230 kU 时，涂膜断面的裂纹和气孔进一步减少，断面更加平整，又出现宽度大于10 nm 的裂痕。复合涂膜染色切片的TEM 检测结果反映涂膜内部纳米粒子的粒径及分散状态。由图2 可知，壳聚糖分子质量为60 kU 时，涂膜内分散着5～20 nm 的纳米粒子，并有少量大颗粒团簇状粒子。 壳聚糖分子质量为100 kU 时，涂膜内纳米粒子粒径小于10 nm，分散不均，并有较多呈链状和簇状团聚。 壳聚糖分子质量为160 kU 时，涂膜内均匀分散着粒径20 nm 以上的纳米粒子， 基本无团聚现象。 壳聚糖分子质量为230 kU 时，涂膜内纳米粒子分散均匀，平均粒径约5 nm，无团聚现象。

图1 不同分子质量壳聚糖的原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜断面的SEM 图Fig.1 The SEM images of in-situ modified nano CaCO3-chitosan composite coatings with different molecular weight of chitosan

图2 不同分子质量壳聚糖的原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜的TEM 图Fig.2 The TEM images of in-situ modified nano CaCO3-chitosan composite coatings with different molecular weight of chitosan

壳聚糖的分子质量影响复合涂膜的断面微观形貌及其中原位改性纳米CaCO3粒子的分散状态， 这可能是由于壳聚糖分子质量影响涂膜的脱水过程。当壳聚糖分子质量较小时，对纳米粒子的分散有显著影响。 适当分子质量的壳聚糖分子与CaCO3分子间作用力均匀， 在脱水过程中有序排列，因而对粒子的分散起促进作用。而壳聚糖的分子质量过小时，由于分子链太短，与CaCO3粒子的相容性差，使涂膜脱水后出现较大裂痕，因而会造成纳米粒子间团聚，不利于膜性能提高。当壳聚糖分子质量过大时，分子链长度增加，壳聚糖分子间可能发生缠绕，影响其与CaCO3的相互作用，进而使涂膜的结构和性能发生改变。

2.1.2 不同分子质量壳聚糖的原位改性纳米Ca-CO3复合保鲜涂膜的XRD、FT-IR 分析 由图3a可知， 原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜的XRD 谱图在2θ 分别为8°，11°，15°，18°，22°附近有明显的衍射峰， 说明壳聚糖经处理后出现3 种晶型结构，包括在2θ=8°和2θ=11°附近的水合态，2θ=16°附近的非水合态和2θ 在20°～22°范围的无定形态，这与武娇等[27]和OGAWA 等[30]的研究结果一致。 当壳聚糖分子质量从60 kU 升至160 kU时，壳聚糖的特征衍射峰强度基本无变化，而其衍射角度略有偏移， 说明形成的水合态及非水合态壳聚糖晶体的结构略有差异。 当壳聚糖分子质量为230 kU 时，壳聚糖水合态和非水合态晶体的特征峰明显减弱， 说明高分子质量的壳聚糖脱水后不易形成晶体。 在XRD 衍射图谱中未发现CaCO3的特征衍射峰， 这可能是由于纳米CaCO3在壳聚糖溶液中以非晶态形式存在或因其含量过少，故衍射峰未能检出。

由图3b 可知，3 500～3 300 cm-1处的吸收峰是由-OH 和-NH2的伸缩振动引起的。壳聚糖分子中的甲基和次甲基引起2 927 cm-1和2 859 cm-1处吸收振动峰形成。 2 359 cm-1和2 334 cm-1处的显著吸收峰是因二氧化碳存在形成的。1 645 cm-1，1 555 cm-1，1 336 cm-1的吸收峰为壳聚糖酰胺I、酰胺II 和酰胺III 的特征峰[24，31]。 1 536 cm-1和1 154 cm-1处为壳聚糖糖苷键的特征吸收峰[32]。1 050 cm-1处的宽吸收峰为非晶态CaCO3的吸收峰。 669 cm-1处为壳聚糖结晶敏感吸收峰[33]。 当壳聚糖分子质量为60 kU 时，吸收峰强度较弱；壳聚糖分子质量增加后，吸收峰强度增加。随着壳聚糖分子质量的变化，其特征吸收峰发生不同程度的偏移，说明壳聚糖分子质量影响涂膜脱水过程及其结晶状态，与XRD 分析结果一致。 同样，非晶态CaCO3的吸收峰强度变化说明壳聚糖分子质量影响其与原位改性CaCO3纳米表面改性基团的键合方式， 进而影响纳米粒子在涂膜中的分布。

图3 不同分子质量壳聚糖的原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜的XRD（1）和FT-IR（2）谱图Fig.3 The XRD （1）and FT-IR （2）patterns of in-situ modified nano CaCO3-chitosan composite coatings with different molecular weight of chitosan

2.2 壳聚糖分子质量对原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合保鲜涂膜理化性能的影响

由表1 可见， 当壳聚糖分子质量为160 kU时，纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜的拉伸强度和断裂伸长率值最大，此时复合涂膜的机械性能最强，这与韩英等[22]研究结果一致。 分析认为，适当分子质量的壳聚糖分子排列有利于壳聚糖分子与纳米CaCO3粒子表面活性基团形成氢键， 其分子间氢键相互作用力越强，二者结合越紧密，膜的机械强度越高。当壳聚糖分子质量过低或过高时，均不利于复合涂膜机械性能的提升。脱水成膜后，复合涂膜内部的断裂和孔隙表明纳米CaCO3在壳聚糖涂膜中分散不均，两者的结合强度较差，涂膜机械性能较差。 涂膜的内部孔隙结构及分子间的相互作用决定涂膜透气性能的高低。 良好的涂膜微气调环境由较低的氧气透过率和较高的二氧化碳透过率组成，抑制需氧微生物的繁殖和生长。由表1 可知，当壳聚糖分子质量为160 kU 时，复合涂膜的氧气透过率较小，而二氧化碳透过率较大，说明该复合涂膜能够形成抑制微生物活动的微气调环境，这与涂膜的微观结构有关。纳米复合涂膜的透光性与分子间的相容性相关。透光性越大，分子间的相容性越好，反之越差。 由表1 可知，随着壳聚糖分子质量的增加，纳米复合涂膜的透光性增大。当壳聚糖分子质量为160 kU 和230 kU 时， 纳米复合涂膜的透光性较大， 说明壳聚糖与CaCO3的分子间相容性较好。综上所述，当壳聚糖分子质量为160 kU 时， 复合涂膜的机械性能及透光性较好，并且能够形成良好的微气调环境。

表1 不同分子质量壳聚糖的原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜的理化性能分析Table 1 The physicochemical properties of in-situ modified nano CaCO3-chitosan composite coatings with different molecular weight of chitosan

2.3 壳聚糖分子质量对冷藏过程中美国红鱼保鲜性能的影响

2.3.1 美国红鱼在贮藏过程中感官评分及相关生化指标变化 感官评分是评价水产品新鲜度的一种重要手段，也是决定消费者购买欲的主要因素。用不同分子质量的壳聚糖复合涂膜对美国红鱼保鲜处理，从外观、气味、肌肉色泽3 个方面对其感官评分，其中，9 分为满分，6 分为可接受限值。 由图4a 可知，各组美国红鱼的感官评分随着贮藏时间延长，均呈现下降趋势。这可能是美国红鱼自身体内酶和微生物的共同作用，使鱼体在外观、气味和色泽上都变差。 从第9 天起， 分子质量为160 kU 的壳聚糖组鱼肉感官评分下降缓慢，与其它组呈现出显著性差异。空白组、分子质量为60 KU 和160 KU 的壳聚糖组的美国红鱼对应的感官评分分别在第10 天、 第12 天和第15 天达到可接受限值下限。pH 值是评价肉类产品新鲜程度的重要指标。由图4b 可知，随着贮藏时间延长，美国红鱼的pH 值逐渐降低，并在第6 天达到最小值。 这是因为鱼死后，鱼体肌肉中的糖原发生糖酵解作用，生成乳酸类物质，引起美国红鱼pH 值降低。 随着美国红鱼贮藏时间延长，其pH 值又呈显著上升趋势。可能是因为鱼体自身酶和微生物的共同作用，促使鱼肉中蛋白质和氨基酸等含氮物质被降解为氨、 三甲胺和吲哚等碱性物质， 导致美国红鱼肉pH 值升高，这与武娇等[27]研究结果一致。 分子质量为160 kU 的壳聚糖组美国红鱼贮藏6 d 后，pH值较空白组和分子质量为60 kU 的壳聚糖组升高趋势缓慢， 说明该涂膜有效抑制美国红鱼鱼肉中蛋白质和氨基酸的分解。因鱼肉具有高水分含量、高脂肪和高蛋白等特点，加之鱼体内、外大量微生物和自身酶作用，引起脂肪氧化，蛋白质降解，并产生不良气味和形态， 这些是导致鱼类变质的直接原因[34]。由图4c-4f 可知，随着贮藏时间延长，美国红鱼的菌落总数、TBA、TVB-N 和K 值都呈逐渐升高趋势。其中，经复合涂膜处理的美国红鱼各指标上升缓慢，均低于同期空白组，且分子质量为160 kU 的壳聚糖组保鲜性能更优。 菌落总数（TVC）是反映微生物生长情况的重要指标之一，而微生物的生长状况可以用来衡量水产品的腐败程度。 按照国家海水鱼类卫生标准菌落总数（TVC）小于4 lg（CFU/g）为1 级鲜度，TVC 小于6lg（CFU/g）为2 级鲜度的标准，空白组、分子质量分别为60 kU 和160 kU 壳聚糖组鱼肉分别在第8，10，12 天达到2 级鲜度下限值。 肉类产品中不饱和脂肪酸含量较高，且易氧化，其氧化产生的丙二醛在一定条件下可与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成稳定的显色化合物，即TBA 值越高，肉类脂肪的氧化程度越高， 导致生成的醛酮类等小分子的物质也随之增加，说明肉类的酸败程度越大[26]。TBA 可作为水产品中衡量鱼肉脂肪氧化程度的一个重要指标。由图4d 可知道，随着贮藏时间延长，美国红鱼的TBA 值逐渐上升，并且空白组增加较为显著，分子质量为60 kU 和160 kU 壳聚糖组增加缓慢。 从第6 天起，分子质量为160 kU 的壳聚糖组TBA 值增加速度低于分子质量为60 kU 的壳聚糖组。 挥发性盐基氮是评价水产品鲜度的一个重要指标。 在鱼体自身内源酶及微生物的共同作用下，鱼肉中蛋白质降解，产生胺类等挥发性物质。 TVB-N 与感官评分有很高的相关性。 TVB-N含量低于13 mg/100 g 时为1 级新鲜度； 低于30 mg/100 g 时为2 级新鲜度， 同时也作为水产品品质被消费者接受的最低限度[35]。 由图4e 可知，随着贮藏时间延长， 空白组TVB-N 含量显著增加，在第13 天达到限值；分子质量为60 kU 的壳聚糖组在第15 天达到限值； 而分子质量为160 kU 的壳聚糖组在第15 天仍处于2 级鲜度。K 值作为衡量水产品鲜度的重要指标， 被广泛应用。 鱼体死后，机体细胞等物质仍保持较高活性，细胞内ATP在含Mg2+的ATP 酶的作用下，分解成ADP、AMP、IMP、HxR 和Hx。 一般认为K 值低于10%，该鱼处于1 级鲜度状态； 当K 值在20%～40%范围时，该鱼属于2 级鲜度；K 值在60%～80%范围时， 可判定鱼开始腐败[36]。 由图4f 可知，随着贮藏时间延长，空白组、壳聚糖分子质量分别为60 kU 和160 kU 时各组鱼肉分别在第11，12，15 天达到2 级鲜度下限。

研究结果表明， 壳聚糖分子质量为160 kU时，原位合成纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜保鲜性能更优。 分析认为， 复合涂膜中壳聚糖分子与CaCO3粒子相容性较好， 氢键作用较强且分子排列整齐，涂膜断面无裂痕。 又因其机械性能优良，水蒸气透过量和氧气透过率值较低， 在保鲜贮藏过程中，涂膜的阻隔性能较高。 此外，壳聚糖在酸性条件下，氨基质子化程度较高，带正电荷的壳聚糖分子与菌体内带负电荷的核酸类物质结合，能有效防止外界微生物的入侵， 抑制微生物的生长和繁殖，降低蛋白质和脂肪的分解速度，进而减缓鱼体腐败。

图4 不同分子质量壳聚糖复合涂膜处理的美国红鱼在贮藏过程中的感官评分及生化指标Fig.4 The sensory and biochemical indicators of Sciaenops ocellatus in the storage process treated by the composite coatings with different molecular weight of chitosan

2.3.2 美国红鱼冷藏保鲜过程中质构指标变化 水产品死后，在内源酶和外界微生物的作用下，鱼体肌原纤维分解，肌肉的硬度、弹性和回复性等质构性能变差。 由图5 可知道，随着贮藏时间延长，美国红鱼的硬度、弹性、咀嚼度和回复性降低，原位合成纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜处理组鱼肉的质构指标下降速度比空白组慢， 且分子质量为160 kU 的壳聚糖组下降速度最慢。从第9 天起，空白组的美国红鱼硬度值急剧下降， 而经过复合涂膜处理的美国红鱼的硬度值变化缓慢。在前6 天，鱼肉的弹性和回复性变化缓慢。分析认为，贮藏前6 天鱼体内糖原分解，处于僵直期，此期间虽然鱼体的肌肉组织弹性和回复性较大， 但是变化不显著，这与pH 值一致。 随着贮藏时间延长，复合壳聚糖涂膜处理的美国红鱼各项质构指标显著优于空白组，当分子质量为160 kU 时，复合涂膜保鲜效果更优，这与其微观结构和理化性能有关。

3 结论

壳聚糖分子质量为160 kU 时，原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜的微观结构和理化性能较好。与其它分子质量的壳聚糖复合涂膜相比，该复合涂膜中纳米粒子粒径均匀、大小合适，并且均匀分散，粒子间相容性高，拉伸强度、断裂伸长率和二氧化碳透过率值提高，氧气透过率值降低。

图5 不同分子质量壳聚糖复合涂膜保鲜的美国红鱼在贮藏过程中的质构指标Fig.5 The texture of Sciaenops ocellatus in the storage process treated by the composite coatings with different molecular weight of chitosan

不同分子质量的原位改性纳米CaCO3-壳聚糖复合涂膜对美国红鱼均有保鲜作用。其中，分子质量为160 kU 的壳聚糖组处理的美国红鱼的感官评分与同期其它处理组相比较高， 微生物被较好地抑制，pH、TBA、TVB-N 和K 值变化缓慢，鱼肉质构指标下降速度缓慢， 说明该涂膜可延长货架期，保持美国红鱼优良的品质并节约成本。