低氧诱导因子-1α 通过提高miR-210-3p 表达水平促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移

王 慧， 尚政军

（湖北省口腔基础医学重点实验室·省部共建国家重点实验室培育基地，武汉大学口腔生物医学教育部重点实验室，湖北 武汉 430072）

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔颌面部最常见的一类恶性肿瘤[1]。 2018 年， 口腔癌新增病例约35.4 万例，其中90%的口腔癌是OSCC[2]。 由于预后不良，OSCC 致死率较高[3]。 因此，需要在现有治疗水平的基础上进一步寻找新的治疗方法。

低氧诱导因子-1α（HIF-1α）最早由Semenza 等[4]发现，是一种对氧敏感的转录激活因子。 大多数实体瘤组织内都存在缺氧现象，细胞和组织对缺氧的适应导致一系列基因的转录诱导。 介导这种适应性反应的主要因子是HIF-1α[4]。 当局部组织缺氧状态持续存在时， 细胞内HIF-1α 的表达量就会增加，从而导致下游一系列靶基因表达发生生物效应变化[5]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类单链小分子非编码RNA， 约含22 nt。 它们通过与靶点信使RNA(mRNA)的3′-UTR 进行碱基互补配对，在转录后调控靶基因表达方面发挥重要作用[6]。 自miRNA被发现以来， 大量文献报道了多种miRNA 在不同肿瘤中异常表达， 揭示了其与肿瘤之间关系密切[7]。肿瘤的发生及发展过程十分复杂，其中涉及大量基因的表达变化和分子表达水平的改变。 在OSCC 进展过程中，仅仅在迁移、增殖方面就有多种miRNA在其中担任不同角色。 更有肿瘤细胞干性、肿瘤细胞促血管生成等方面的研究提示， 大量miRNA 参与了肿瘤的发生、发展。这些研究提示，miRNA 在未来可以作为治疗靶点研发新药物。MiR-210-3p 与多种疾病发生、发展有着密切的关系，可作为一些疾病的生物标志物， 也参与了肿瘤的迁移、 增殖、分化、凋亡等过程[8-9]。 因与HIF-1α 之间的相互作用，使miR-210-3p 成为机体重要的缺氧调控因子[10]。 目前，两者之间的协调作用以及miR-210-3p 在OSCC中的生物效应尚未有相关研究。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

胎牛血清（Gibco 公司，美国），DMEM 高糖培养基（HyClone 公司，美国），miR-210-3p 模拟物和miR-210-3p抑制物（上海吉玛制药技术有限公司，中国），RIPA裂解液（Beyotime 公司，中国），HIF-1α、β-actin 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司， 中国），Highgene 转染试剂（Abclonal 公司，中国），CCK-8 试剂盒（同仁公司，日本）。

1.2 细胞培养

人OSCC 细胞系（CAL-27）购自中国典型培养物保藏中心。 将CAL-27 细胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和1%双抗的DMEM 高糖培养基中，于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。低氧培养条件为37 ℃、94%N2、5%CO2、1%O2。

1.3 逆转录聚合酶链反应

将细胞置于6 孔板中培养后丢弃培养基，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, PBS）洗2 遍后于每孔中各加入1 mL TRIzol 试剂， 反复吹打后转移至无酶EP 管。 每管加入200 μL 三氯甲烷溶液，充分振荡后离心，取上清液加入500 μL 异丙醇，混匀后离心。 将离心后得到的RNA 进行沉淀，DEPC（diethyl pyrocarbonate）水配制的75%的乙醇洗涤2 次后用适量65 ℃的DEPC 水溶解。测量RNA 浓度后，使用生工miRNA 逆转录试剂盒（加尾法）逆转录为cDNA，设计miR-210-3p 特异性上游引物，并以U6为内参进行逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR, RT-PCR） 检测。 所用引物序列为：MiR-210-3p 上 游 引 物，5′-CTGTGCGTGTGACAGC-GG-3′；U6 上游引物，5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′。 下游引物由生工生物miRNA 逆转录试剂盒（加尾法）提供。

1.4 Western 印迹法

在处理后的细胞中加入100~150 μL 含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液，冰浴裂解，离心后取上清液，采用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒测定蛋白浓度。 加入20%体积的蛋白上样缓冲液。 使用12.5%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）-聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE） 进行电泳并转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，使用5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗于4 ℃下孵育过夜。 TBST 缓冲液洗膜，二抗孵育1 h，再次洗膜后孵育于发光液中，并通过发光仪器进行检测。

1.5 细胞转染

细胞接种并贴壁后， 根据说明书提示使用Highgene 转染试剂将miR-210-3p 模拟物和miR-210-3p 抑制物及其相应的阴性对照（NC）转染至细胞中， 得到miR-210-3p 模拟物组、miR-210-3p 模拟物-NC 组、miR-210-3p 抑制物组及miR-210-3p 抑制物-NC 组。 继续培养24 h，RT-PCR 检测其转染效率。

1.6 CCK-8 法检测细胞增殖

将分组处理过的细胞以5 000 个/孔的密度接种于96 孔板中， 分别培养24、36、48 h 后， 按照CCK-8 试剂盒说明书提示，加入CCK-8 试剂培养2 h，使用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度值。

1.7 划痕实验

接种细胞至6 孔板中， 待细胞生长至80%～90%后用1 mL 无菌移液枪头垂直孔板底划3 条直线，相邻直线间距0.5 cm，确保每条直线宽度一致。PBS 洗去漂浮细胞后加入无血清培养基继续培养。分别于培养0、3、6、12 h 时显微镜下观测并拍照记录。 使用Image J 软件测量细胞迁移距离。

1.8 统计学分析

实验中所有数据均采用SPSS 21.0 分析， 样本间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 时表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低氧诱导CAL-27 细胞内HIF-1ɑ 及miR-210-3p 表达水平升高

将CAL-27 细胞置于低氧培养箱分别培养12、24、48 h 后， 提取处理过的细胞及正常条件培养的CAL-27 细胞总蛋白和总RNA，用Western 印迹法检测细胞内HIF-1ɑ 的表达量。 结果显示，低氧条件下（1% O2）培养48 h 后，细胞内HIF-1ɑ 表达量明显升高（图1A）。

RT-PCR 检测上述细胞内miR-210-3p 的表达量，发现低氧条件培养24 h 和48 h 后，细胞内miR-210-3p 表达量均显著升高，并呈逐渐增加的趋势（图1B）。

2.2 HIF-1ɑ 促使CAL-27 细胞内miR-210-3p 表达水平上升

在CAL-27 培养基中加入人工合成的HIF-1ɑ，常氧条件下（20%O2）培养24 h 后，提取细胞总RNA，RT-PCR 检测细胞中miR-210-3p 的表达量。 结果显示，HIF-1ɑ 刺激细胞后，细胞内miR-210-3p 表达量升高（图2）。

2.3 CAL-27 细胞内miR-210-3p 水平的变化导致细胞迁移能力的改变

将miR-210-3p 模拟物和miR-210-3p 抑制物及其相应的NC 组转染至细胞中，转染24 h 后提取细胞总RNA，检测转染效率。 RT-PCR 结果显示，相比各自的NC 组，miR-210-3p 模拟物组转染24 h 后，CAL-27 细胞内miR-210-3p 表达量显著上升（图3A）；转染miR-210-3p 抑制物的细胞内miR-210-3p 表达量下降（图3A）。

图1 低氧诱导后CAL-27 细胞内HIF-1ɑ 与miR-210-3p 的水平变化Figure 1 Changes of HIF-1ɑ and miR-210-3p levels in CAL-27 cells after hypoxia induction

图2 经HIF-1ɑ 刺激后的CAL-27 细胞内miR-210-3p 的表达水平Figure 2 Expression level of miR-210-3p in CAL-27 cells after HIF-1ɑ stimulation

转染后的细胞用划痕实验检测其迁移能力是否发生了改变。 结果显示，相同时间内相比各自的NC 组， 转染miR-210-3p 模拟物的CAL-27 细胞迁移能力提升（图3B、图4A～4F）；而转染miR-210-3p抑制物的细胞迁移能力下降（图3B、图4G～4L）。

2.4 CAL-27 细胞内miR-210-3p 水平的变化导致细胞增殖能力的改变

用CCK-8 实验检测上述转染后细胞增殖能力的改变。 结果显示，转染24、48、72 h 后，相比对照组，miR-210-3p 模拟物可以促进CAL-27 细胞增殖（图5A）；miR-210-3p 抑制物降低细胞内miR-210-3p 表达量后，CAL-27 细胞的增殖能力则受到显著抑制（图5B）。

图3 不同处理组CAL-27 细胞内miR-210-3p 的水平及细胞迁移能力的改变Figure 3 Changes in miR-210-3p level and cell migration ability in CAL-27 cells of different treatment groups

图4 细胞迁移实验（×100）Figure 4 Cell migration experiment（×100）

图5 CAL-27 细胞内miR-210-3p 水平的变化后细胞增殖能力的改变Figure 5 Changes in cell proliferation ability after changes in miR-210-3p levels in CAL-27 cells

3 讨论

虽然近年来关于肿瘤各个方面的研究越来越多，但大多数癌症发生、发展的具体分子机制和致病机制至今尚不明确。OSCC 生长速度较快，其生长时需大量供氧。 因此，肿瘤组织的生长必然伴随着缺氧环境的形成。HIF-1ɑ 是肿瘤组织在低氧状态下调节自身适应环境的关键因子[6-7,11-12]。

MiR-210-3p 在多种肿瘤组织及患者血清中存在异常表达，提示miR-210-3p 可能在肿瘤发生或发展过程中起一定作用。因miR-210-3p 在肺腺癌组织中的高表达使其可能成为预测及诊断肺腺癌的标志物； 在非小细胞肺癌患者中，miR-210-3p 高表达者比低表达者的无瘤生存率低，预后更差[13]；卵巢癌患者血清中miR-210-3p 表达增高，且其表达水平与患者淋巴结转移程度、 国际妇产科联盟（FIGO）分期、分化程度及组织类型相关[14]。 已有研究表明，miR-210-3p 与OSCC 也相关， 与正常口腔上皮组织相比，OSCC 组织中miR-210-3p 表达量更多[15-16]。 但有关miR-210-3p 在OSCC 发生、发展中扮演角色的研究,至今尚无报道。

有学者从对围绕HIF-1ɑ 的低氧相关通路的研究中发现，与HIF-1ɑ 关系最密切的miRNA 是miR-210-3p[10]。 据已有研究证明， HIF-1ɑ 与miR-210-3p之间存在正反馈通路， 两者相互作用抑制对方降解，从而实现浓度积累[17-18]。 而沉默HIF-1ɑ 后，低氧条件不能导致施万细胞内miR-210-3p 的积累[19]。

实验证实，低氧状态下，OSCC 细胞中表达了更多的HIF-1ɑ， 而增多了的HIF-1ɑ 导致细胞内miR-210-3p 表达量升高。我们发现上调miR-210-3p 可以促进CAL-27 细胞增殖和迁移， 而下调miR-210-3p则导致CAL-27 细胞增殖和迁移能力下降。可推断，OSCC 组织内持续存在的低氧状态必然导致HIF-1ɑ水平升高， 而HIF-1ɑ 带来了一系列应对缺氧环境的改变，其中一个就是通过上调miR-210-3p 的表达量来促进肿瘤生长及进展。MiR-210-3p 可以作为研究OSCC 治疗方法的新靶点。