长链非编码RNA DLX6-AS1 调控微小RNA-15b 和磷脂酶D1 影响口腔鳞状细胞癌侵袭转移的分子机制研究

杨利杰， 田欣欣， 管臻洁

（郑州大学第一附属医院口腔医学中心，河南 郑州 450002）

口腔鳞状细胞癌简称口腔鳞癌，占口腔颌面部恶性肿瘤的80%[1]， 其较高的发病率严重威胁人类生命健康。 口腔鳞癌常发生淋巴结转移和远处转移，多为局部复发，因此治疗效果不佳[2]。 探讨口腔鳞癌发生、发展的分子机制并寻找治疗靶点是当前口腔医生的重要任务。 长链非编码RNA（lncRNA）是一类小分子单链非编码RNA，其可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)与微小RNA （miRNA） 相互作用调控miRNA 靶基因的表达，与肿瘤发生、发展密切相关[3]。 生长停滞特异性蛋白6-反义RNA1（DLX6-AS1）是近年来新发现的一种lncRNA，其在非小细胞肺癌、宫颈癌、结直肠癌等肿瘤细胞中表达增高，降低其表达可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，是肿瘤治疗的潜在靶点[4-6]。 但DLX6-AS1 在口腔鳞癌中的表达及其对口腔鳞癌细胞迁移和侵袭的影响，目前还未知。 生物信息学软件预测显示，miR-15b 可能是DLX6-AS1的靶基因，DLX6-AS1 可能作为miR-15b 的内源性RNA 调控miR-15b 靶基因的表达。 有报道称，miR-15b 在口腔鳞癌组织中表达降低， 过表达miR-15b可抑制口腔鳞癌细胞Cal27 增殖，并诱导细胞凋亡，在口腔鳞癌中发挥抑癌基因作用[7]。 生物信息学软件预测显示，磷脂酶D1（PLD1）是miR-15b 的靶基因。 磷脂酶可将磷脂酰胆碱水解生成磷脂酸和胆碱，影响细胞的增殖、迁移和侵袭等生理功能[8]。 研究显示，PLD1 可促进胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌等肿瘤的发生和发展[9-11]，但其在口腔鳞癌中的作用还未知。 本研究以miR-15b/PLD1 轴为切入点，深入探讨DLX6-AS1 对口腔鳞癌细胞增殖、 迁移和侵袭的影响，以期为该肿瘤复发、转移分子机制的阐明及治疗靶点的选择提供一定实验依据。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集2016 年12 月—2018 年5 月于本院确诊并进行手术治疗的38 例口腔鳞癌患者的癌组织和对应的癌旁组织，液氮保存，其中癌旁组织距离癌组织边缘＞3 cm，病理检测未发现癌细胞。38 例患者中男性25 例，女性13 例，年龄47～72 岁，平均年龄（65.29±5.78）岁。 TNM 分期：Ⅰ期9 例，Ⅱ期11 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期8 例；淋巴结转移16 例，淋巴结未转移22 例。 排除标准：①术前行放、化疗等治疗的患者；②心脏、肾等重要器官功能不全者；③临床资料不完整的病例；④患有免疫系统疾病者。 本研究经医院伦理委员会批准同意，患者或其家属自愿签署知情同意书。

1.2 细胞和实验试剂

口腔鳞癌细胞HSC3 （中国科学院上海细胞库），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI 1640 培养基和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）， 四甲基噻唑蓝（MTT）和胰蛋白酶 （美国Sigma 公司），LipofectamineTM 2000 试剂盒和TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司），逆转录试剂盒和PCR 试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司），PCR 引物（昆明擎科生物科技有限公司），兔抗人p21、MMP-2、E-cadherin 及PLD1 多克隆 抗体（美国Santa Cruz 公司），双荧光素酶活性检测试剂盒（美国Promega 公司），DLX6-AS1 小干扰RNA、乱序无意义阴性序列、miR-15b 模拟物、miR-15b 抑制剂及阴性序列、PLD1 过表达载体及荧光素酶报告载体（上海吉玛制药技术有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 HSC3 细胞培养 复苏HSC3 细胞， 将其培养于含10 % FBS 的RPMI 1640 培养基中， 并置于37 ℃、5%CO2、97%湿度的培养箱中培养。 显微镜下观察细胞生长情况，及时更换新鲜培养基。 当培养瓶底部的细胞融合至80%左右时，0.25%胰蛋白酶溶液消化，进行传代培养。

1.3.2 细胞分组和转染 调整对数增殖期HSC3 细胞浓度为2.5×104个/mL， 以每孔2.5 mL 的量接种于6 孔板中。 待细胞融合至60%时， 参照LipofectamineTM 2000 试剂盒说明书，分别转染DLX6-AS1小干扰RNA（si-DLX6-AS1 组）、乱序无意义阴性序列 （si-NC 组）、DLX6-AS1 过表达载体（pcDNA3.1-DLX6-AS1 组）、空载体（pcDNA3.1 组）、miR-15b 模拟物（miR-15b 组）、模拟物对照（miR-NC 组）、miR-15b 抑制剂 （anti-miR-15b 组）、 抑制剂对照（antimiR-NC 组）， 共 转 染DLX6-AS1 小 干 扰RNA 与miR-15b 抑制剂 （si-DLX6-AS1+anti-miR-15b 组）、DLX6-AS1 小干扰RNA 与抑制剂阴性对照（si-DLX6-AS1 +anti-miR-NC 组）、DLX6-AS1 小 干 扰RNA 与PLD1 过表达载体（si-DLX6-AS1+pcDNA3.1-PLD1 组）、DLX6-AS1 小 干 扰RNA 与 空 载 体（si-DLX6-AS1+pcDNA3.1 组）至HSC3 细胞。 转染24 h后，更换新鲜培养基。 继续培养24 h，收集细胞用于后续实验。

1.3.3 RT-qPCR 检测DLX6-AS1、miR-15b 和PLD1 mRNA 表达水平 应用TRIzol 试剂提取口腔鳞癌组织或细胞中总RNA， 微量核酸仪检测RNA 浓度和纯度后， 参照逆转录试剂盒说明书将其合成为cDNA。 然后以cDNA 为模板，进行扩增。 DLX6-AS1上游引物：5′-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3′，下游引 物：5′-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3′；miR-15b上 游 引 物：5′-ACACTCCAGCTGGGTTAGCAGCACATCAT-3′，下游引物：5′-CACAGCTCGTAGAACAG GAGG-3′；PLD1 上游引物：5′-GAGCCACGGGTAAA TACCTCT-3′， 下游引物：5′-CCGCGTGTCCAGATT TTCTATG-3′；GAPDH 上 游 引 物：5′-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′， 下游引物：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT-3′；U6 上 游 引 物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′ ， 下 游 引 物：5′ -ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR 扩增条件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 个循环。 DLX6-AS1 和PLD1 以GAPDH 为内参，miR-15b 以U6 为内参， 采用2-△△Ct法计算DLX6-AS1、miR-15b 和PLD1 mRNA 的相对表达水平。

1.3.4 MTT 法检测HSC3 细胞增殖 调整各组转染后的HSC3 细胞浓度为2.5×104个/mL，以每孔200 μL 的量接种于96 孔板中， 每组设置3 个复孔。培养48 h 后，加入20 μL 的MTT（5 g/L），继续孵育4 h。 取出培养板，将培养基吸弃后每孔加入150 μL的二甲基亚砜，振荡混匀，于酶标仪490 nm 处测定吸光度值。细胞存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。实验重复3 次，取平均值。

1.3.5 Transwell 检测HSC3 细胞迁移和侵袭 用不含FBS 的RPMI 1640 培养基调整各组转染后的HSC3 细胞浓度为5×104个/mL。 迁移实验中，在Transwell 上室中直接加入100 μL 细胞悬液， 在下室中加入500 μL 含FBS 的RPMI 1640 培养基。 侵袭实验中， 先在Transwell 上室铺设Matrigel 基质胶， 然后加入100 μL 细胞悬液， 下室加入500 μL含FBS 的RPMI 1640 培养基。 培养48 h 后，吸弃培养基，取出上室。 经4 %多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min，棉签擦去未穿膜细胞，倒置显微镜观察，随机选取5 个视野，对穿膜细胞进行计数。

1.3.6 Western Blot 检测HSC3 细胞中p21、MMP-2、E-cadherin 和PLD1 蛋白表达 各组转染后的细胞培养48 h 后，收集细胞。 加入RIPA 蛋白裂解液，置于冰上充分裂解30 min，提取细胞中总蛋白。 用BCA 蛋白试剂盒测定蛋白浓度并进行定量。 取适量蛋白溶液，100 ℃煮沸5 min，变性后，以每泳道30 μg 上样量行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 电泳后，将分离的蛋白湿转至聚偏乙烯二氟膜， 并于5%脱脂奶粉溶液中封闭2 h。 分别加入p21 （稀释度1∶800）、MMP-2 （稀释度1∶1 000）、Ecadherin（稀释度1∶600）和PLD1（稀释度1∶800）抗体，4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释度1∶200），37 ℃下孵育1 h。 滴加增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显影液，避光显影后，凝胶成像系统曝光拍照。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验 生物信息学软件预测显示，miR-15b 与DLX6-AS1 和核苷酸序列存在连续结合位点，PLD1 的3′非翻译区（3′untranslated region，3′UTR） 存在与miR-15b 结合的核苷酸序列。 PCR 分别扩增含miR-15b 结合位点的DLX6-AS1 序列及PLD1 的3′UTR 序列， 并通过基因定点突变技术将结合位点突变， 分别构建DLX6-AS1 野生型（WT-DLX6-AS1）、突变型（MUT-DLX6-AS1）和PLD1 野生型（WT-PLD1）、突变型（MUT-PLD1）荧光素酶载体。 分别将荧光素酶载体与miR-15b 模拟物或阴性对照共转染至HSC3 细胞。 转染24 h 后，收集各组细胞。 参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，检测各组的荧光素酶活性。

1.4 统计学分析

SPSS 22.0 软件分析实验数据。 计量资料以均数±标准差（±s）表示。 2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验。 以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 口腔鳞癌组织中DLX6-AS1、miR-15b 和PLD1的表达水平

与癌旁组织比较， 口腔鳞癌组织中DLX6-AS1和PLD1 mRNA 表达水平升高 （P＜0.001），miR-15b表达水平降低（P＜0.001）。TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期的口腔鳞癌组织中的DLX6-AS1 表达水平高于Ⅰ～Ⅱ期口腔鳞癌组织（P＜0.001），而miR-15b 的表达水平低于Ⅰ～Ⅱ期口腔鳞癌组织（P＜0.001）。 发生淋巴结转移的患者口腔鳞癌组织中的DLX6-AS1 表达水平高于未发生淋巴结转移患者的口腔鳞癌组织（P＜0.001），而miR-15b 表达水平低于未发生淋巴结转移的患者口腔鳞癌组织（P＜0.001）。 详见表1、图1。

2.2 抑制DLX6-AS1 表达对HSC3 细胞活性、迁移和侵袭的影响

si-DLX6-AS1 组HSC3 细胞DLX6-AS1 表 达 水平低于si-NC 组（P＜0.001），表明DLX6-AS1 小干扰RNA 转染成功，HSC3 细胞中DLX6-AS1 表达受到抑制。 与si-NC 组比较，si-DLX6-AS1 组HSC3 细胞存活率、迁移和侵袭数及MMP-2 蛋白水平降低（P＜0.001），p21 和E-cadherin 蛋白水平升高（P＜0.001）。详见图2。

表1 DLX6-AS1、miR-15b 与临床分期及转移之间的关系Table 1 Relationship between DLX6-AS1, miR-15b and clinical stage and metastasis

图1 口腔鳞癌组织中DLX6-AS1、miR-15b 和PLD1 mRNA 的表达水平Figure 1 Expression level of DLX6-AS1, miR-15b and PLD1 mRNA in oral squamous cell carcinoma

2.3 DLX6-AS1 靶向负调控miR-15b

生物信息学软件预测显示，DLX6-AS1 与miR-15b 的核苷酸序列存在结合位点。 双荧光素酶活性检测显示，miR-15b 模拟物可降低WT-DLX6-AS1 载体的荧光素酶活性（P＜0.001）， 对MUT-DLX6-AS1载体的荧光素酶活性无显著影响（P＞0.05）。 pcDNA3.1-DLX6-AS1 组miR-15b 表达水平低于pcDNA3.1 组（P＜0.001），si-DLX6-AS1 组miR-15b 表达水平高于si-NC 组（P＜0.001）。 详见图3。

2.4 抑制miR-15b 表达降低抑制DLX6-AS1 对HSC3 细胞活性、迁移和侵袭的抑制作用

与si-DLX6-AS1+anti-miR-NC 组比较，si-DLX6-AS1+anti-miR-15b 组HSC3 细胞存活率、 迁移和侵袭数及MMP-2 蛋白表达水平升高 （P＜0.001），miR-15b 及p21、E-cadherin 蛋 白 表 达 水 平 降 低 （P＜0.001）。 详见图4。

2.5 过表达PLD1 降低抑制DLX6-AS1 对HSC3 细胞活性、迁移和侵袭的抑制作用

与si-DLX6-AS1+pcDNA3.1 组比较，si-DLX6-AS1+pcDNA3.1-PLD1 组HSC3 细胞存活率、迁移和侵袭数及PLD1、MMP-2 蛋白 表达水平 升高 （P＜0.001），p21 和E-cadherin 蛋白表达水平降低 （P＜0.001）。 详见图5。

2.6 miR-15b 靶向负调控PLD1 表达

生物信息学软件预测显示，PLD1 的3′UTR 与miR-15b 的核苷酸序列存在结合位点。 双荧光素酶活性检测显示，miR-15b 模拟物可降低WT-PLD1 载体的荧光素酶活性（P＜0.001），对MUT-PLD1 载体的荧光素酶活性无显著影响（P＞0.05）。 miR-15b 组PLD1 的mRNA 和蛋白水平低于miR-NC 组 （P＜0.001），anti-miR-15b 组PLD1 的mRNA 和 蛋 白 水 平高于anti-miR-NC 组（P＜0.001）。 详见图6。

图2 抑制DLX6-AS1 对HSC3 细胞的细胞活性、迁移和侵袭及p21、E-cadherin 和MMP-2 蛋白表达的影响Figure 2 Inhibition of DLX6-AS1 on the cell activity, migration and invasion of HSC3 cells, and the expression of p21, E-cadherin andMMP-2

图3 DLX6-AS1 靶向调控miR-15bFigure 3 DLX6-AS1 targeting regulation miR-15b

3 讨论

图4 抑制miR-15b 表达降低抑制DLX6-AS1 对HSC3 细胞的细胞活性、迁移、侵袭及p21、E-cadherin 和MMP-2 蛋白表达的影响Figure 4 Inhibition of miR-15b reduces the effect of inhibition of DLX6-AS1 on cell activity, migration, invasion and expression of p21,E-cadherin and MMP-2 in HSC3 cells

图5 过表达PLD1 能减弱抑制DLX6-AS1 对HSC3 细胞的细胞活性、迁移、侵袭及p21、E-cadherin 和MMP-2 蛋白表达的影响Figure 5 Overexpression of PLD1 attenuates the inhibition of DLX6-AS1 on cell activity, migration, invasion and expression of p21, Ecadherin and MMP-2 in HSC3 cells

图6 MiR-15b 靶向调控PLD1Figure 6 MiR-15b targeting PLD1

近年来，lncRNA 在肿瘤中的作用受到广泛关注。 DLX6-AS1 是一种新型lncRNA。 Fang 等[12]的研究结果显示，膀胱癌组织中DXL6-AS1 表达上调，其高表达通过介导miR-223 基因沉默而上调HSP90B1 蛋白的表达，增强膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力，促进膀胱癌发展。 Liang 等[13]的研究显示，DLX6-AS1 在胃癌组织和细胞系中表达上调， 其高表达与肿瘤T3、T4 期的侵袭、远处转移及预后不良有关。 DLX6-AS1 通过与miR-204-5p 结合并上调蛋白表达，促进了胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化， 是潜在的胃癌预后生物标志物和治疗靶标。 目前，DLX6-AS1 对口腔鳞癌复发转移的影响还未知。

本研究显示， 口腔鳞癌组织中DLX6-AS1 表达水平升高， 且其表达与患者TNM 分期及淋巴结转移情况密切相关， 提示DLX6-AS1 可能参与口腔鳞癌的发生与发展。转染DLX6-AS1 小干扰RNA 至口腔鳞癌细胞HSC3 后的结果显示， 抑制DLX6-AS1表达后，HSC3 的细胞存活率及迁移和侵袭的细胞数降低， 提示抑制DLX6-AS1 表达可抑制HSC3 细胞增殖、迁移和侵袭，是降低口腔鳞癌复发和转移的潜在分子靶点。p21 是肿瘤抑制因子，参与细胞周期的调控， 其表达增加可抑制肿瘤细胞增殖[14]。MMP-2 可降解细胞外基质和基底膜，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[15]。 E-cadherin 是黏附因子，其表达降低或缺失能使细胞获得侵袭性表型[16]。本研究显示，抑制DLX6-AS1 表达后，HSC3 细胞中MMP-2 蛋白表达降低，而p21 和E-cadherin 蛋白表达升高，提示抑制DLX6-AS1 表达通过下调MMP-2 蛋白表达和上调p21、E-cadherin 蛋白表达而抑制HSC3 细胞的增殖、迁移和侵袭。

生物信息学软件预测显示，miR-15b 可能是DLX6-AS1 的靶基因。 本研究通过双荧光素酶活性报告实验证实了DLX6-AS1 可与miR-15b 的核苷酸序列靶向结合。 此外，上调HSC3 细胞中DLX6-AS1表达后，miR-15b 表达降低，而下调DLX6-AS1 表达后，miR-15b 表达升高，提示DLX6-AS1 在HSC3 细胞中靶向负调控miR-15b。 本研究还显示，miR-15b在口腔鳞癌组织中表达降低，与相关研究报道结果一致[7]。抑制miR-15b 表达降低了抑制DLX6-AS1 表达对HSC3 细胞增殖、 迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响， 提示DLX6-AS1 通过靶向上调miR-15b 表达发挥抗口腔鳞癌作用。

为了进一步探究DLX6-AS1 靶向调控miR-15b表达抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制， 本研究应用生物信息学软件预测， 结果显示PLD1 是miR-15b 的靶基因。 PLD1 参与调控细胞的增殖、侵袭等恶性生物学行为。 如Kang 等[17]的研究显示，结直肠癌细胞中PLD1 表达升高，抑制PLD1表达， 通过抑制Wnt/β-catenin 和PI3K 信号通路的激活降低结直肠癌细胞的增殖能力，是结直肠癌的潜在治疗靶点。目前，还未见PLD1 影响口腔鳞癌细胞恶性生物学行为的相关报道。 本研究显示，口腔鳞癌组织中PLD1 mRNA 表达水平升高， 提示其在该肿瘤中也发挥促癌基因作用。 本研究还显示，miR-15b 靶向负调控PLD1，过表达PLD1 降低了抑制DLX6-AS1 表达对HSC3 细胞增殖、 迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响，提示DLX6-AS1 作为miR-15b 的内源性RNA 与miR-15b 相互作用，通过下调PLD1 表达抑制口腔鳞癌复发和转移。 然而，DLX6-AS1 下游靶miRNA 及miR-15b 下游靶mRNA 众多，进一步研究DLX6-AS1 下游miRNA/mRNA 通路是下一步的重点。

综上所述， 口腔鳞癌组织中DLX6-AS1 呈高表达， 抑制DLX6-AS1 表达可降低口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其可能通过与miR-15b 相互作用进而下调PLD1 表达发挥作用，为口腔鳞癌复发、转移分子机制的阐明及治疗靶点的选择提供了新思路。