穿心莲内酯纳米粒对口腔鳞癌HN6 细胞株和白斑Leuk1 细胞株抑制作用的实验研究

李宏权， 姜继宗， 马亭云， 吴玉波， 钱文昊， 王长虹

（1. 上海市徐汇区牙病防治所，上海 200032；2. 上海中医药大学中药研究所，上海 201203）

口腔白斑为口腔最重要的潜在恶性病变，是口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）的主要来源之一。 白斑由增生到异常增生再到癌变，是一个致癌基因改变逐步积累后，导致细胞异常和不可控生长，直到癌症发生的多步骤过程[1]。2015 年全球有354 864 例新发口腔癌[2]，口腔鳞癌已成世界范围的健康问题。 目前，筛选中药有效成分被认为是一个探求肿瘤化学预防药物的有效途径。

穿心莲内酯（andrographolide，AND）是源于穿心莲（andrographis paniculata）的二萜内酯类化合物，具有抗炎[3]、抗肿瘤[4]等活性。Yang 等[5]证实，AND 有抗OSCC 增殖的活性。Manoharan 等[6]证实AND 有防治仓鼠颊囊癌变的活性。 陈博艺等[7]总结出AND是通过诱导肿瘤细胞凋亡、影响不同细胞周期蛋白的表达、抑制肿瘤细胞周期进展等方面，发挥其抗肿瘤作用。 但AND 溶解度低、 生物利用度差的缺点，限制了其临床应用。 纳米载体是提高药物生物利用度的有效方式[8]。Yang 等[9]证实，载有AND 的固体 脂 质 纳 米 粒 （AND-solid lipid nanoparticles，AND-SLNs）可增加AND 溶解度，SLNs 是增加AND生物利用度的理想载体。 本研究通过对比纳米化的AND（AND-SLNs）与普通AND，对OSCC 或白斑细胞株细胞抑制作用的差异， 探讨纳米化能否增强AND 的抗肿瘤增殖作用，为体内实验提供基础。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂

1.1.1 实验用药物 AND-SLNs 与AND 由上海中医药大学王长虹教授团队提供，保存于恒温干燥箱中。 AND 纯度为98%。 实验用每批次AND-SLNs 浓度由王长虹教授团队制备后用HPLC 法测量获得；现用现配，80 ℃水浴后用0.22 μm 滤器过滤。

1.1.2 实验用细胞系及培养条件 OSCC 细胞系HN6 由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔肿瘤实验室（上海市口腔重点实验室）提供，口腔白斑细胞系Leuk1 由美国马里兰州马里兰大学牙科学院毛力教授提供。 将HN6 细胞置于DMEM 高糖培养液 （上海源培生物科技股份有限公司，C40306）中培养。 将Leuk1 细胞置于人角化上皮细胞培养液[（keratinocyte serum free medium, K-SFM）+表皮生长因子]中培养。 所有细胞均在37 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内培养。 参照美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）提供的标准培养条件在10 cm 培养皿中养殖细胞。 待细胞在预成培养液中生长至70%～80% 时接种。

1.2 细胞实验

1.2.1 细胞摄取药物定量实验研究[10]HN6、Leuk1 细胞系以1×105个/mL 的细胞密度分别接种在2 块24 孔板中孵育，每孔1 mL。 孵育24 h 细胞贴壁后，24 孔板培养液中加入适量的AND-SLNs 和AND 药物储存液， 使培养液中2 种药物均有8、80 μg/mL共2 种质量浓度，在37 °C 培养箱内孵育2 h，各有3 个复孔。 去除培养液，24 孔板内加入300 μL/孔的4%的多聚甲醛溶液固定10 min； 磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤1 次，时长5 min。按200 μL/孔加入细胞裂解液EBC（不加蛋白酶抑制剂），轻微振荡15 min。 细胞裂解液中的AND 药物质量浓度用高效液相色谱仪（HPLC）检测。

1.2.2 细胞增殖抑制试验（MTS 法）[11]HN6 和Leuk1细胞以30 个/μL 的细胞密度接种于96 孔板内。 在96 孔板最外一圈的孔内只加入PBS， 排除边缘效应。 96 孔板置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内过夜。 次日，吸除一侧纵行6 孔内培养液，立即加入用培养液配制好的药液，AND-SLNs 和AND 在96 孔板中从200 μg/mL 的原始质量浓度依次稀释9 次， 即200、100、50、25、2.5、0.25、0.025、0.002 5、0.000 25 和0.000 025 μg/mL 共10 个质量浓度梯度，每个质量浓度的药物各有6 个复孔， 放入培养箱内，分别培养24、48、72、96 h。 在1 mL 的CellTiter 96®AQueous One Solution Reagent 内加入5 mL 的PBS（1∶5 稀释）混合备用。 在各个时间点，吸去相应孔内培养液。 立即在每孔内加入120 μL 准备好的CellTiter 96®Aqueous One Solution Reagent/PBS 混合液。将96 孔板置于培养箱内，作用4 h 后取出。用SunriseTM光吸收酶标仪检测每孔在490 nm 的吸光度值（optical density,OD 值）。 存活率＝实验组OD值/空白对照组OD值× 100%。 实验重复3 次。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞增殖周期阻滞实验[12]以细胞增殖抑制实验获得2 种药物在48 h 时HN6、Leuk1 细胞的IC50 值为实验组药物质量浓度，配取相应培养液及没有药物的培养液作为阴性空白对照。 HN6 和Leuk1 以3 × 104个/mL 的细胞密度各10 mL 接种于6 个10 cm 的培养皿中，饥饿过夜、待细胞贴壁。 37 ℃培养箱孵育12 h，0.25%胰酶消化，每组收集大约6×105个细胞， 室温下以1 000 r/min的速率离心3 min， 用3 mL 预冷的PBS 洗涤1 次，在4 ℃下用3 mL 预冷的70%乙醇溶液固定4 h或过夜。 细胞再以1 000 r/min 速率离心3 min，用预冷的PBS 洗涤1 次， 用402.75 μL 冷的PBS 重悬细胞，加入2.25 μL 的核糖核酸酶A（RNase A）（10 mg/mL）和45 μL 的碘化丙啶（propidium iodide，PI）（1 mg/mL），4 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪分析。 实验重复3 次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡实验[13]HN6 和Leuk1以3×104个/mL 的细胞密度接种，2.5 mL/孔，各3 块6 孔板，过夜待细胞贴壁。 次日，吸除1 块6 孔板中的培养液， 加入含有48 h IC50 质量浓度的药物培养液，培养箱内孵育12 h；再去除1 块6 孔板中的培养液， 加入含有48 h 的IC50 质量浓度的药物培养液，培养箱内孵育6 h；第3 块6 孔板作为阴性空白对照。孵育结束后，按Alexa Fluor ®488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit 试剂盒要求收集细胞，用冷的PBS 洗涤1 次。转移细胞悬液至流式管内，1 000 r/min 速率离心3 min，重新离心细胞，弃上清液， 并用1 × 膜联蛋白结合缓冲液100 μL 重悬细胞。在含有约2.25 × 105个细胞的悬液100 μL 中加入5 μL 的Annexin V-FITC （Annexin V-fluorescein isothiocyante）和5 μL 的50 μg/mL PI 工作液；在室温、避光条件下，共同孵育15 min。在冰上，将400 μL的1 × 膜联蛋白结合缓冲液加入100 μL 的细胞悬液中并轻柔混合后，用流式细胞仪和随机软件分析细胞凋亡结果。 实验重复3 次。

1.3 统计方法

2 结果

用SPSS 19.0 软件统计处理实验数据， 用独立样本t检验分析。 用GraphPad Prism 6.0 作统计图。P＜0.05 判断为差异有统计学意义。

2.1 细胞定量摄取实验

HN6 细胞经AND-SLNs 处理后以8、80 μg/mL的质量浓度分别孵育2 h 后，吸收AND 的量为24.20、82.84 μg/mL，对应AND 组的吸收量为0.00、9.17 μg/mL。AND-SLNs 组细胞吸收量均比AND 组多，且随药物质量浓度的增加细胞吸收量也增加（图1A）。

Leuk1 细胞经AND-SLNs 处理后以8、80 μg/mL的质量浓度分别孵育2 h 后， 吸收AND 的量为6.28、13.46 μg/mL， 对应AND 组的吸收量为6.06、16.81 μg/mL。 同质量浓度AND-SLNs 和AND 的药物吸收量相差不明显，但均随药物质量浓度的增加而增加（图1B）。

图1 HPLC 定量检测细胞摄取药物实验Figure 1 Cellular uptake in quantitive examination by HPLC

2.2 细胞生长增殖抑制试验（MTS 法）

如图2A 和2B 所示， 药物作用于HN6 细胞48 h后，AND-SLNs 和AND 的IC50 分别为6.09、13.75 μg/mL。 药物作用于Leuk1 细胞48 h 后，AND-SLNs 和AND 的IC50 分别为0.72、26.14 μg/mL。

图2 用MTS 方法进行细胞增殖抑制实验Figure 2 Cell viability assay by MTS

2.3 流式细胞仪分析细胞周期阻滞实验

6.09 μg/mL 的AND-SLNs 和13.75 μg/mL 的AND 作用于HN6 细胞12 h， 在细胞G0/G1 期为（55.41±2.00）%对（30.75±9.33）%，P=0.01；在细胞增殖期（G2/M+S）为（44.59±2.00）%对（69.25±9.33）%，P=0.039。 详见图3A、3B。

0.72 μg/mL 的AND-SLNs 和26.14 μg/mL 的AND 作用于Leuk1 细胞12 h， 在细胞G0/G1 期为（61.65±7.62）%对（41.49±4.34）%，P=0.016；在细胞增殖期（G2/M+S）为（38.35±7.62）%对（58.51±4.34）%，P=0.026。 详见图3C、3D。

2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡实验

6.09 μg/mL 的AND-SLNs 和13.75 μg/mL 的AND 作用于HN6 细胞6 h 或12 h 后的情况如下。6 h 的早期凋亡率为（5.45±0.36）%对（3.74±0.04）%，P=0.022；晚期凋亡率为（2.62±0.32）%对（1.59±0.23）%，P＞0.05；总凋亡率为（8.06±0.68）%对（5.33%±0.27）%，P=0.034（图4A、4B）。 12 h 早期凋亡率为（3.24±0.23）%对（3.38±0.39）%，P＞0.05；晚期凋亡率为（7.04±0.38）%对（1.46±0.08）%，P=0.002；总凋亡率为（10.28±0.16）%对（4.84±0.30）%，P=0.002（图4C、4D）。 部分差异有统计学意义，与药物抑制增殖曲线相符。

图3 流式细胞仪检测细胞周期阻滞实验Figure 3 Cell cycle analysis by flow cytometry

0.72 μg/mL 的AND-SLNs 和26.14 μg/mL 的AND 作用于Leuk1 细胞6 h 或12 h 后的凋亡率如下。 6 h 早期凋亡率为（0.47±0.17）%对（0.36±0.02）%，P＞0.05； 晚期凋亡率为 （11.30±0.04）%对 （11.53±0.04）%，P＞0.05； 总 凋 亡 率 为 （11.77±0.13）%对（11.88±0.01）%，P＞0.05（图4E、4F）。 12 h 早期凋亡率为（0.30±0.01）%对（0.43±0.13）%，P＞0.05；晚期凋亡率为（23.73±0.11）%对（14.27±0.69）%，P=0.003；总的凋亡率为（23.99±0.11）% 对（14.70±0.81）%，P=0.004（图4G、4H）。 部分差异有统计学差异，与药物抑制增殖曲线相符。

3 讨论

3.1 关于穿心莲有效成分通过纳米技术提高生物利用度的思考

纳米化学预防最早由Mukhtar 团队提出[14]。 姜黄[15]、染料木黄酮[16]等化学预防药物研究显示，纳米粒子载药系统能使天然植物药物减毒。

AND 纳米化研究证明， 纳米剂型改变的AND可优化细胞表面转运方式、 提高生物利用度、 增强AND 生物活性，可作为治疗疾病的新剂型[17-18]。为研究植物天然产物AND 应用于预防和治疗OSCC 的可能，本课题组与上海中医药大学中药研究所王长虹教授的团队合作， 其中关于AND-SLNs 及AND的制备和特性已发表[9,19]。 通过体外细胞实验，探索具有抗癌活性的AND 纳米化后， 被细胞摄取的情况和抑制OSCC 和白斑细胞增殖的效果。

图4 Annexin V-PI 凋亡实验Figure 4 Annexin V-PI apoptosis assay

3.2 AND 及其固体脂质纳米粒抗OSCC 细胞和白斑细胞的有效性和差异性

细胞定量摄取药物实验结果显示，AND-SLNs更能促进HN6 细胞对AND 的吸收，且具有浓度-时间依赖性和一定的细胞特异性。 本实验说明ANDSLNs 更能促进细胞对AND 的吸收， 固体脂质纳米粒作为载体促使AND 进入细胞内达到较高程度的聚集，从而提高AND 的生物利用度。

细胞增殖抑制实验结果证明，AND 纳米化后仍具有抑制OSCC 增殖的活性， 同时两者也均有抑制白斑细胞增殖的活性。 这与Wang 等[20]的研究结果相符。 实验结果显示AND-SLNs 对2 个细胞系在48 h 的IC50 均小于AND，且具有时间-浓度依赖性和一定的细胞特异性， 证明AND-SLNs 抑制OSCC和白斑细胞增殖的生物活性比单纯AND 更强。

细胞周期阻滞实验结果证明，AND-SLNs 比单纯的AND 更明显阻滞HN6 和Leuk1 细胞增殖周期于G0/G1 期， 其阻滞细胞增殖周期的活性更强，进而能更强地抑制细胞进入生长增殖期。

细胞凋亡实验证明，AND-SLNs 在作用HN6 和Leuk1 细胞6 h 和12 h 后，与AND 的作用相比均有统计学差异，说明AND-SLNs 具有更强的诱导细胞凋亡的生物活性， 从而证明AND-SLNs 抗OSCC 和白斑细胞的活性更强。

3.3 AND 及其固体脂质纳米粒抗OSCC 细胞和白斑细胞可能的机制

Roy[17]、Yang[9]、Yen[18]及杨涛等[19]对AND 纳米化的研究结果均表明，以相应的纳米粒作为载体能够增强细胞对AND 的摄取， 提高AND 的生物利用度，增强AND 的生物活性，加强对寄生虫的杀灭，显著恢复小鼠受损的肝功能， 更好地稳定血压、更强地抑制癌细胞增殖和抑制胃肠道炎症反应。

本研究提示可能由于纳米载体促进了细胞对药物摄取，提高药物在靶细胞中的浓度，从而明显抑制细胞生长增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡，表现出更强的抗OSCC 细胞和白斑细胞活性。 但其具体作用机制和信号通路还待进一步研究。

3.4 体外细胞实验结果与体内实验研究展望

Wang[20]、Manoharan[6]、Hsieh[21]及Yang 等[5]均 通过体内实验证明了AND 具有防治口腔黏膜癌变的活性。 本次实验显示，纳米化的AND 抗OSCC 细胞和白斑细胞的增殖活性强于单纯的AND，因而可考虑进一步应用合适的动物模型，通过体内实验来阐明纳米化的AND 在白斑恶性转变过程的作用。 此外， 相关AND 的靶向配体可靶向连接纳米粒到癌细胞表面过度表达的特异性受体。 因此，研究AND的靶向配体可为临床上使用AND 化学预防白斑癌变提供实验依据。

综上所述， 本文的体外细胞实验初步证明，纳米化的AND 对OSCC 细胞和白斑细胞具有更显著的抗增殖活性的潜能。 本次实验表明AND-SLNs 纳米剂型有望成为抗癌化学预防药物的第1 步，为下一步的体内研究提供了实验基础。