p53在低氧调控人牙周膜成纤维细胞增殖与凋亡中的作用*

王 勤 庄秀妹 何杰玉 张 叶 彭雪珍

牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是牙周韧带的主要功能细胞，PDLCs数量减少与结构破坏导致牙周支持组织损伤，诱导或加重牙周组织疾病[1，2]。厌氧菌、咬合创伤、炎症以及吸烟均可造成牙周微环境的局部缺血和低氧状态，低氧可抑制人PDLCs增殖并促进其凋亡[3]。牙周炎患者牙周组织中的低氧标志蛋白——低氧诱导因子 -1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)水平相比正常人显著升高[4]。我们前期研究已证实，低氧可以通过激活HIF-1α调控PDLCs的增殖与凋亡[5]。

p53是关键的肿瘤抑制基因，能够抑制肿瘤细胞的增殖[6]。最新研究发现，p53在牙周炎组织中升高，并与局部组织的低氧状态相关[7]。然而，p53是否参与低氧抑制PDLCs增殖并促进其凋亡？p53与HIF-1α作用关系如何？这些均不清楚？本研究分析常氧和低氧(1%O2)下PDLCs中p53与HIF-1α表达，通过小干扰RNA敲低技术探讨p53在低氧环境下PDLCs增殖及凋亡的作用。

1.材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 FBS、胰酶、DMEM培养基均购自Gibco公司。小鼠抗人HIF-1α、p53、GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠二抗购于Proteintech公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma-Aldrich公司；细胞凋亡试剂盒购自联科生物；其余化学试剂为国产分析纯产品。常氧组CO2细胞培养箱(5%CO2)购自Thermo，低氧组CO2细胞培养箱(5%CO2、1%O2)为英国New Brunswick生产的GALAXY 48R型号CO2培养箱。

1.2 PDLCs的原代培养 选择15～22岁患者因正畸需要拔出的前磨牙，拔出时牙根完整，且无牙周、牙体、牙髓、根尖病变，取得患者知情同意。具体方法如下：去除根端血迹，刮取根中1/3牙周膜组织，采用组织块法以含20%胎牛血清(FBS)、1∶100双抗的DMEM培养基原代培养PDLCs。约第6天细胞生长达80%，胰酶消化传代，后继续在含10%FBS、1∶100双抗的DMEM培养基中培养，前5代PDLCs用于实验。

1.3 四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞活性检测 将5×103个PDLCs接种于96孔板中，按实验分组分别于常氧或低氧培养，加入20μL/孔MTT溶液继续孵育4h，去除培养液，加入150μL/孔DMSO后低速振荡10 min使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。该实验重复三次。

1.4 细胞凋亡实验 收集经低氧及siRNA处理后PDLCs上清液及细胞，PBS洗2次，用1×binding buffer调整细胞浓度为1×106-7个/mL，取200μL细胞悬液，加入5μL Annexin V-APC后避光孵育15 min，再加入10μL PI，混匀后上机检测。

1.5 Western免疫印迹 按分组收集PDLCs裂解蛋白进行抽提并定量。取等量总蛋白沸水中煮7min，8%SDS-PAGE电泳分离后，将凝胶上蛋白经转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉2h，加入一抗4℃孵育过夜，之后转入HRP标记的二抗室温孵育2h，ECL化学发光显影扫描。

1.6 实时定量PCR 收集的细胞用Trizol裂解，提取总RNA，紫外分光光度计测量RNA含量。取 1μg RNA合成 cDNA，按 Takara公司Quant SYBR Green PCR kit试剂操作说明进行扩增。应用Primer Premier 5.0软件设计Real-time PCR引物，HIF-1α引物序列为：Forward 5’-GTGCCACATCATCACCATA-3’，Reverse 5’-CAAAGCGACAGATAACACG-3’；p53 引物序列为：Forward 5’-CAGCACATGACGGAGGTTGT-3’，Reverse 5’-TCATCCAAATACTCCACACGC-3’；内参GAPDH序列为：Forw ard 5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，Reverse 5’-CTGGACTGGACGGCAGATCT-3’。按公式计算求得各样品基因相对表达量。对照组基因相对表达量为1。

1.7 细胞转染 HIF1α-siRNA、p53、NC-siRNA均购自上海吉玛生物科技公司，HIF1α-Si1 靶序列为 5’-CTGATGACCAGCA ACTTGA-3’，HIF1α-Si2 靶序列为：5’-GGAAATGAGAGA AATGCTTAC-3’，p53-Si1 靶序列为5’-CCACUΜGAΜGGAGAGUAUU-3’，p53-Si2靶序列为：5’-TGCGTGTGGAGTATTTGGAT-3’，NC-siRNA 靶序列为：5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

根据说明在六孔板中使用Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent 转染 PDLCs，并设计阴性对照siRNA为NC-Si组，终浓度为50nM，培养48h，提取蛋白、RNA并进行后续研究。

1.8 统计学处理 数据以表示。各实验至少重复3次，采用SPSS13.0软件包分析结果。对两组实验数据进行校正t检验，若P＜0.05则差异被视为有统计学意义。

2.结果

2.1 低氧促进PDLCs中p53表达 在本研究中，Western免疫印迹证实低氧培养48h后PDLCs的HIF-1α相较常氧组显著上调(灰度值：常氧组(56.65±4.35)；低氧组(101.63±10.98)；t=3.888，P=0.018)，与此同时，低氧组PDLCs的p53表达也明显升高(灰度值：常氧组(81.36±10.93)；低氧组(142.52±7.784)；t＝4.561，P=0.011)；此外，实时定量PCR也在mRNA水平进一步证实低氧状态下PDLCs中HIF-1α表达上升3.89倍(t=6.260，P=0.003)，p53表达上升3.07倍(t=6.963，P=0.002)(图 1)。

图1 低氧培养48h后PDLCs中HIF-1α与p53蛋白和mRNA水平变化(*：P＜0.05)

2.2 敲低HIF-1α可下调低氧下PDLCs中p53表达 w estern免疫印迹证实PDLCs中HIF1α-Si1、Si2转染组相比NC-Si阴性组中HIF-1α分别下降 51.86%(t=4.747，P=0.009)与 53.81%(t=5.355，P=0.006)，而 p53表达分别下降28.54%(t=2.849，P=0.046)与 34.01%(t=3.105，P=0.036)(图 2)。

2.3 敲低p53不影响低氧下PDLCs中HIF-1α表达 为进一步探讨p53是否为HIF-1α的下游因子，PDLCs转染p53-siRNA，w estern免疫印迹证实PDLCs中p53-Si1、Si2组相比NC-Si阴性组中p53表达分别下降66.52%(t=10.69，P=0.0004)与 71.84%(t=10.79，P=0.0004)，差异具有统计学意义；然而，HIF-1α表达均无明显变化(t-Si1=0.1793，P=0.866；t-Si2=0.4364，P=0.685)，无统计学差异(图3)。

图2 敲低HIF-1α后低氧下PDLCs中HIF-1α与p53蛋白水平变化(*：P＜0.05，与NC-Si组比较)

图3 敲低p53后低氧下PDLCs中HIF-1α与p53蛋白水平变化(*：P＜0.05)

2.4 敲低p53促进PDLCs增殖 将各转染组细胞在低氧下培养48h，MTT检测发现p53-Si1、Si2组PDLCs吸光度值较NC-Si组分别升高2.04倍(t=5.138，P=0.0068)与 1.87 倍(t=4.112，P=0.0147)，差异具有统计学意义(图4)。

图4 敲低p53后低氧对PDLCs细胞活性的影响(*：P＜ 0.05)

2.5敲低p53后可抑制PDLCs凋亡 流式细胞凋亡检测结果显示，将各转染组细胞在低氧下培养48h后，p53-Si1、Si2组PDLCs凋亡细胞数目比NC-Si组分别减少57.53%(t=12.58，P=0.0002)与54.72%(t=9.798，P=0.0006)，具有统计学差异(图 5)。

图5 敲低p53后低氧对PDLCs细胞凋亡的影响(*：P＜ 0.05)

3.讨论

PDLCs是牙周组织中含量最丰富的间质细胞，对牙周组织的形成与再生有重要影响。慢性牙周炎组织中毒性物质堆积、毛细血管供血不足，造成牙周微环境中局部低氧状态[9，10]。一般情况下，低氧诱导细胞内血管内皮生长因子上升、同时进行无氧代谢，可增加局部氧供给并降低氧消耗，产生适应性调节[11，12]。然而，持续性低氧可导致PDLCs数量减少和结构破坏，引起牙周组织损伤，诱导或加重牙周组织疾病[13]。

研究发现，牙周炎患者的牙周组织中低氧标志蛋白——HIF-1α较正常人显著升高，提示低氧局部牙周微环境可能与牙周炎的发生和发展密切相关[4]。我们前期研究已证实，低氧可以通过激活HIF-1α 调控 PDLCs的增殖和凋亡[5，14]。Song 等[3]通过铁螯合剂氯化钴阻断氧信号传递，建立低氧模型，证实氯化钴化学建立的低氧环境可抑制人PDLCs增殖并促进其凋亡。我们前期研究直接通过低氧培养箱建立低氧微环境，发现PDLC在低氧下培养48h、72h时细胞增殖活力下降、凋亡增加，随着低氧处理时间的增加，细胞存活率逐渐降低，进一步提示了长时间低氧环境是慢性牙周炎发展的重要原因。此外，低氧促进PDLC中HIF-1α的表达上升，小干扰RNA敲低HIF-1α可逆转低氧抑制PDLCs增殖与促进其凋亡，说明低氧通过HIF-1α 对 PDLCs的增殖和凋亡起作用[5，14]。

p53是关键的肿瘤抑制基因，其编码的p53蛋白主要分布于细胞核浆，与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化以及泛素化等翻译后修饰调控。p53好似“基因组卫士”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性，能够抑制肿瘤细胞的增殖[6]。研究证实，p53在牙周炎组织中升高，并与局部组织的低氧状态相关[7]。本研究发现，PDLCs在低氧培养后p53协同HIF-1α一起表达升高，通过小干扰RNA敲低HIF-1α后发现p53表达也随之降低，提示p53可能是受低氧与HIF-1α调控表达；进一步敲低p53表达发现HIF-1水平无明显变化，再次说明p53可能是HIF-1α的下游基因。此外，敲低PDLCs中p53表达后，低氧环境中PDLCs的增殖能力增强、凋亡比例降低，进一步说明p53是低氧抑制PDLCs增殖、促进其凋亡的重要节点，并受HIF-1α调控。还研究发现，低氧可通过HIF-1α介导BNIP与mTOR表达，促进PDLCs发生自吞噬与凋亡[3]。因此，p53与HIF-1α介导低氧促PDLCs凋亡与牙周炎进展的具体机制仍有待进一步探讨。

综上，本研究在PDLCs中证实低氧能通过上调p53抑制PDLCs增殖并促进其凋亡，并且p53受HIF-1α调控。低氧是促进牙周炎发生与发展的重要因素，靶向降低PDLCs中HIF-1α和p53表达可能是防治牙周炎的研究重点。