基于PCR-DGGE法分析酱菜中乳酸菌群落结构

燕平梅，昝宏雷，赵文婧，陈燕飞，乔宏萍

(1.太原师范学院 生物系，太原 030619；2.土壤消毒活化绿色产业技术创新战略联盟，太原 030619)

酱菜，一种历史悠久的中国特色小菜，是将新鲜的蔬菜先用高浓度的盐水腌制后，通过清水冲洗或者压榨等方法，使腌制蔬菜中的食盐浓度降低，之后再次用酱来酱制，这些酱包括酱油、甜面酱、干黄酱、黄酱等，通过这种方法制作的蔬菜中含有酱的糖分、氨基酸及维生素等多种营养物质，因此，酱菜成为了中国人爱吃的下饭小菜[1，2]。酱菜自然发酵过程是乳酸菌主导的多种微生物的代谢过程，多种代谢产物和所需低氧环境能够抑制其他食物腐败细菌、霉菌及真菌等微生物生长，从而能使酱菜保持其独特风味而不容易变质。

但是，在生产过程中酱菜很容易生成亚硝酸盐，这样则不利于健康。

研究酱菜中微生物多样性的方法有两种，培养法和非培养法，培养方法是通过应用涂布平板的方式计数并统计，得出最终的微生物多样性结论；非培养法则是通过生化分子的方法研究。非培养方法即基于PCR的变性梯度凝胶电泳，在变性胶梯度电泳中不同序列DNA遇上不同的变性胶浓度而解链，停留在解链位置，从而形成相互分开的条带图谱[3]。随着微生物分子生态学技术的发展，更多的人选择避开纯培养过程中工作量大、繁琐的弊端，而是直接从分子水平上来研究各种样品中微生物区系组成和群落结构[4]。其中，韩国和日本对泡菜的研究较早，在泡菜的研究上运用PCR-DGGE技术也比较多[5，6]。梁新乐等[7]应用PCR-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技术，分别以细菌16S rDNA 的V7～V8区和V3区为引物，研究泡菜样品乳酸菌多样性，结合Quantity One软件，分析计算泡菜中微生物群落结构，并得到了可靠的结果[8]。Rademaker等将该技术运用到酸奶和干酪发酵研究中，通过监测发酵剂的消长动态，研究了乳酸菌的生理变化，建立了T-RFLP信号强度与实际微生物数量的定量关系[9]。本实验以发酵成熟的两种酱菜样品为实验材料，以细菌16S rDNA的V7～V8区为引物，探究酱菜中微生物群落结构。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6种酱菜(黄瓜)：购于太原市沃尔玛超市、美特好超市和华联超市。根据含盐量分为两类：一类含盐量低的酱菜用JA表示，另一类含盐量高的酱菜用JB表示。细菌基因组DNA提取试剂盒：天根时代生物有限公司。

1.2 仪器与设备

DcodeTM型凝胶成像仪、变性梯度凝胶电泳仪 Bio-Rad公司；TC-96(G)H(b)B基因扩增仪 杭州博日科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酱菜卤亚硝酸盐含量和食盐浓度的测定

亚硝酸盐按照国标GB/T 5009.33-2008《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》进行测定[10]。

泡菜卤食盐浓度采用硝酸银滴定法进行测定。

1.3.2 16S rDNA V7～V8片段的PCR

16S rDNA V7～V8片段的上下引物分别为：WBAC1：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCACCGCG；WBAC2：GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA。

模板DNA1.5 μL，引物1 μL(10 μg)，Mix 12.5 μL，PCR反应物共25 μL。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

1.3.3 16S rDNA 的V7～V8基因片段DGGE

取PCR产物20 μL进行DGGE实验，变性剂梯度范围为30%～55%。聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%(其中变性剂由尿素浓度为7 mol/L和40%的去离子甲酰胺组成)。200 V、60 ℃下电泳 4 h。采用SYBR Green染色。

从DGGE电泳结果中回收电泳带，以其中的DNA为模板PCR反应，将PCR产物与pGM-T Vector载体连接，转化细胞，测序鉴定阳性克隆。

1.3.4 DGGE条带结构分析

DGGE图谱用Quantity One软件分析。用电泳条带的光密度峰值除以该条带所在泳道所有条带光密度峰值的平均值。DGGE泳道内的电泳条带数量用以计算物种丰富度(R)，由电泳带相对密度计算微生物均匀度(E)及微生物多样性(H)[11]。3种生态指数计算公式为：

H=-∑(ni/N)In(ni/N)；

E=H/InS；

R=S-1/InN。

式中，ni为单一条带的峰面积，N为某一泳道所有峰面积，S为某一泳道的总条带数。

1.3.5 系统发育分析方法

将16S rDNA V7～V8序列提交GenBank中进行BLAST比对，选出与其相似度高的序列，利用MEGA 4.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树，进行系统发育分析。

1.3.6 数据处理

实验重复3次，采用SPSS软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 酱菜中氯化钠浓度和亚硝酸盐含量

不同酱菜中氯化钠浓度和亚硝酸盐含量见表1，两类酱菜中JB食盐浓度要高于JA。低食盐浓度的酱菜JA的亚硝酸盐含量高于食盐浓度高的酱菜JB，但是，两种酱菜中亚硝酸盐含量远低于我国GB 2762-2012中规定的蔬菜及其制品腌渍蔬菜中亚硝酸盐限量指标(20 mg/kg)，都处于国家安全标准内。

表1 不同酱菜中氯化钠浓度和亚硝酸盐含量Table 1 The content of sodium chloride and nitrite in different pickles

2.2 PCR-DGGE结果

由上海生工生物工程技术服务有限公司合成设计的乳酸菌通用引物进行DNA扩增反应，以1.2%琼脂糖凝胶电泳，用紫外成像仪观察，之后用Bio-Rad公司凝胶成像系统拍照，见图1中A。电泳条带清晰，无杂带，提取的DNA质量可以满足DGGE实验的需要。PCR扩增乳酸菌DNA片段后，进行DGGE凝胶电泳，获得乳酸菌DNA区段的DGGE凝胶图谱(见图1中B)，利用Quantity One 软件对DGGE 凝胶图谱中JA和JB两个样品进行分析，软件指示样品有7条条带，其在DGGE胶上表现为条带位置不同、粗细不一、亮暗不同，样品JA和JB中分别含有3，4种微生物，其中3号和6号位置一致，表明两个样品中都有该种微生物；其中1号和4号较粗较亮，说明这两种菌含量较高，从乳酸菌 DNA 样品中共分离得到 7条条带，6种不同的DNA，说明酱菜样品JA和JB乳酸菌共检测到6种不同的DNA信息。

图1 PCR扩增产物的电泳结果(A)和DGGE电泳结果(B)Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplification products (A) and DGGE electrophoresis results (B)

乳酸菌群落结构见表2，两种酱菜微生物丰富度和多样性指数差异显著，低盐酱菜的丰富度和多样性值显著高于高盐酱菜(P<0.05)。两种酱菜微生物均匀度无显著差异(P>0.05)。JA和JB相比，说明食盐对酱菜乳酸菌群落结构有影响。

表2 乳酸菌群落结构Table 2 The community structure of lactic acid bacteria

为了研究酱菜中的微生物种类，回收DGGE电泳结果的条带，通过PCR反应，测定PCR产物碱基序列，提交GenBank库中与已知序列对比而做出鉴定。 JB样品即高盐酱菜的PCR-DGGE泳带有3条，经鉴定。1，2，3与γ-Proteobacterium，Lactobacillus，UnculturedLactobacillus的相似度分别为95%、97%、96%，见表3。JA样品即低盐酱菜的PCR-DGGE泳带有4条，经鉴定，4，5，6，7与Lactobacillus， UnculturedLactobacillus，Lactococcussp.， γ-Proteobacterium的相似度分别为97%、95%、97%、92%，见表3。

表3 DGGE图谱条带测序结果Table 3 The sequencing results of DGGE graph bands

基因序列及参比序列构建的系统发育树见图2和图3。食盐含量对微生物影响很大[12-15]。通常高浓度食盐有利于酵母菌生长，而低浓度食盐则有利于乳酸菌生长[16-18]。低温下6%食盐浓度比8%的能更好地促进乳酸菌生长[19]。低盐酱菜中检测到乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcussp.)，高盐酱菜中检测到乳酸杆菌(Lactobacillus)，未检测到乳球菌属(Lactococcussp.)，可能是食盐浓度高抑制了乳球菌这类乳酸菌的生长。

将测出条带序列与NCBI库已有序列比对，选取比对结果高相似度的构建系统发育树，样品JA和样品JB所有微生物输入Clustal X2中构建系统发育树，见图2和图3。

图2 高盐酱菜JB微生物16S rDNA V7～V8片段基因序列及参比序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed by high-salt pickle JB microbial 16S rDNA V7-V8 fragments’ gene sequence and reference sequence

图3 低盐酱菜JA微生物16S rDNA V7～V8片段基因序列及参比序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed by low-salt pickle JA microbial 16S rDNA V7～V8 fragments’ gene sequence and reference sequence

3 结论

运用PCR-DGGE法研究两类酱菜DGGE图谱，进行乳酸菌群落结构分析，高盐酱菜乳酸菌的多样性指数和丰富度指数显著低于低盐酱菜。两种酱菜样品中既有相同序列的乳酸菌，又有序列不同的乳酸菌，回收电泳DNA序列鉴定的微生物、γ-Proteobacterium和乳酸杆菌(Lactobacillus)是两种酱菜共有的微生物。低盐酱菜中检测到乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcussp.)，高盐酱菜中检测到乳酸杆菌(Lactobacillus)，未检测到乳球菌属(Lactococcussp.)，可能是食盐浓度高抑制了乳球菌这类乳酸菌的生长。

由本实验研究可知，高浓度食盐影响酱菜中乳酸菌的多样性和丰富性。与低浓度食盐浓度相比，高浓度食盐浓度抑制乳酸菌的生长。