酱油安全检测分析技术研究进展

李阳，耿越

(山东师范大学 生命科学学院，山东师范大学食品营养与安全重点实验室，山东省动物抗性生物学重点实验室，济南 250014)

据史料记载，我国在2100多年前已经用大豆为原料制作豆酱，东汉时的“酱清”即为酱油，但在北宋时才正式有了“酱油”的称呼[1]，公元前1世纪，酱油酿造技术传播到了整个亚洲，目前应用广泛，包括西餐和预制食品。

酱油是我国人民生活中必不可少的调味品，其不仅能为菜肴带来鲜美又醇香的口感和风味，而且根据研究报道发现，酱油还具有抗氧化、降血压和抗癌等一些生理功能[2]。我们常说的酱油一般包含酿造酱油和配制酱油，酿造酱油是采用天然发酵的方法，以大豆和/或脱脂大豆、小麦和/或小麦粉和/或麦麸为主要原料(也有人用棉籽饼酿制酱油[3])，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液体调味品；配制酱油是以酿造酱油为主体且比例不少于50%的与酸水解植物蛋白调味液、食品添加剂等配制而成的液体调味品[4]。新出台的GB 2717-2018《食品安全国家标准 酱油》，将酱油的范围做了修改，自2019年12月21日起，酱油仅指酿造酱油，但是该标准的理化指标仅对氨基酸态氮作了要求，无法对酿造酱油及配制酱油进行区分，极易掺假。

酿造酱油的成本远高于配制酱油，所以不少不法商贩会在酿造酱油中掺入酸水解植物蛋白液或其他添加剂来冒充酿造酱油，但研究发现有的酱油不仅不含酿造组分，甚至没有酸水解植物蛋白液，还有许多品牌为了节约成本，会在酿造酱油中添加谷氨酸钠来提高酱油品级[5]。酱油与人们的生活密切相关，所以人们对其安全也格外关注，已有不少研究者建立了鉴别酱油掺假的研究方法。

1 氨基酸分析法

游离态氨基酸在酱油中含量丰富，通常占酱油总含氮量的50%～75%，是衡量酱油品质好坏的重要指标之一[6]，所以很多研究者从氨基酸含量入手，寻找鉴别酱油真假的方法。

冯霞利用全自动氨基酸分析仪对市售酱油(6个月)和陈年酱油(24个月)的中式、韩式两种类型酱油进行氨基酸含量分析，这两种酱油都富含种类全面的氨基酸，特别是人体必需的氨基酸和鲜味氨基酸，虽然陈年酱油的总氮、氨基酸态氮等含量均略低于市售短时间发酵酱油，但二者间差异不太大。

冯志强利用全自动氨基酸分析仪对酱油中氨基酸进行了分析，确定了鉴别酿造酱油和配制酱油的氨基酸指标，但仅能区分酿造酱油，不能确定是否添加了酸水解植物蛋白调味液。后来，该实验另一研究者周芳梅等[7]用全自动氨基酸分析仪通过对8种酿造酱油、2种配制酱油和3种植物蛋白水解液的氨基酸指纹图谱进行分析，建立了鉴别酿造酱油掺假的模型，经实验验证，当酿造酱油中植物蛋白水解液添加量超过10%时，即可鉴别出来。但是该法仅对酱油中的氨基酸含量鉴定作为真假判断，容易使不法商贩抓住漏洞掺假，且仪器性价比不高，有一定的局限性，随着高效液相技术的成熟，该法已逐渐被淘汰，所以此方法现已很少有研究者使用。

2 红外光谱法

红外光谱技术是一种新兴的技术，因操作简便、无需化学试剂，具有省时省力、环保、成本低等优点，且检测精度高，在酱油检测中有优良的发展潜力。

童晓星等[8]通过应用近红外光谱测得透射光谱曲线，结合主成分分析和人工神经网络建立了酱油品牌鉴别模型，结果表明，酱油品牌(8个品牌，共242个样品)的识别率达到98.75%。说明运用近红外光谱可以准确、快速地对酱油品牌进行鉴别。通过光谱信息分析可以得出6920，5985，5536，5481，4488.5 cm-1是酱油的敏感波段，可以进一步研究确定特征波长，进行化学分析。酱油的主要成分有总酸、氨基酸态氮和全氮，通过研究可以进一步得到这些化学成分与光谱指纹的关系，并为开发相应的鉴别仪器提供了依据。

邱丹丹等[9]首次采用傅里叶变换红外光谱结合最小偏二乘法(PLS)，对酿造酱油、酸水解植物蛋白液(AHVP)以及添加不同比例(10%～50%)AHVP制得的配制酱油进行类别分析。结果表明，酿造酱油、酸水解植物蛋白液及配制酱油在以PLS主成分为坐标的二维线性投影图中分布差异明显；通过模型相关系数(R2)和交互验证标准差(RMSECV)比较，筛选出建模光谱波段为4000～500 cm-1，同时确定了最适主因子数为8。利用模型成功对21份盲样进行鉴定，证明利用PLS 建立的模型能有效地检测配制酱油中HVP的添加量，且最大偏差小于3.5%。

酱油中含有16%～20%(W/V)的氯化钠，由于与高盐食品消费有关的健康风险，酱油中的氯化钠含量应至少降至5%～10%(W/V)，因此Moscetti等[10]研究结合几种过程分析技术(PAT)工具，如近红外光谱(NIR)、电导探针和电流发生器的控制策略，开发了电渗析脱盐(ED)建模所需的主要酱油物理化学性质(密度、渗透压、电导率；盐和非盐固体浓度)的NIR模型，并将其应用于实验，明显降低了酱油的含盐量，研究者还提出将该方法用于海水淡化的预想。

红外光谱法分析速度快，可在1 min内完成检测，环保而且对样品无损，便于快速检测，但是它在食品检测方面灵敏度比较低、变动性大，易对结果造成影响；当一种基团在近红外光谱区的多个波长处都有吸收时，谱峰易重叠，影响精度；光谱技术对检测样品数量的精确和样本代表性的要求较高，研究者要具备专业的化学分析知识，遵循标准方法规定进行试验检测。但总体来看，红外光谱技术的优势大于劣势。

3 气相色谱法

气相色谱法的检测速率快、分离效率高、样品进样量少、灵敏度和精确度都很高，所以被广泛应用到各个领域。气相色谱法常与质谱法联用，不仅增强了气相色谱的分离能力和灵敏度，还增加了鉴别和定性的能力。

不同类型的自然酿造酱油生产工艺会导致挥发性组分出现明显差异[11]，所以冯笑军等[12]利用蒸馏萃取/气相色谱-质谱(SDE/GC-MS)方法对4种不同工艺(高盐稀态酿造酱油、低盐固态酿造酱油、常温半固态酿造酱油和配制酱油)生产的酱油香气成分进行了分析，共鉴定出51种化学成分，其中3种酿造酱油中的共有成分为35种。实验发现不同生产工艺的酿造酱油中醇类、酚类、醛酮类、酯类物质的种类均比配制酱油多1倍以上，酸类物质的总含量也远高于配制酱油，但配制酱油的杂环类风味物质比较丰富。酿造酱油中的一些特征香气成分如乙醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇、乙烯基-2-甲氧基-苯酚、4-乙基-苯酚、香草醛、2-羟基丙酸乙酯、乙酸苯甲酯、亚油酸乙酯、十六酸乙酯、5-甲基糠醇、3-苯基呋喃等在配制酱油中都未检出，可以此来鉴别酿造酱油和配制酱油。

易青等[13]结合固相支持液液萃取净化样品前处理技术，建立了无需衍生化反应的在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱同时测定食品中氯丙醇的方法。通过线性实验、空白加标回收实验等方法学实验验证了方法的准确性。与传统的气相质谱-串联质谱衍生化方法相比，本方法简便、快速、经济，适用于食品中氯丙醇的检测。依据食品安全国家标准GB 2762-2012《食品中污染物限量》，实验中采用的20份酱油样品中有4份氯丙醇超标。

酱油样品基质复杂，其分析中的前处理方法尤为重要，固相萃取法是有机分析中最常用的样品前处理方法，可有效地富集目标物及净化干扰物，在酱油样品分析应用中也比较常见。而顶空固相微萃取是在固相萃取技术上发展起来的一种微萃取分离技术，是一种集采样、萃取、浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取新技术。与固相萃取技术相比，固相微萃取操作更简便，携带更方便，操作费用低廉；另外，克服了固相萃取回收率低、吸附剂孔道易堵塞等缺点。因此，已成为目前所采用的样品前处理技术中应用最广泛的方法之一。

肖昭竞[14]采取静态顶空固相微萃取(HS-SPME)的样品前处理方式结合气相色谱-质谱(GC/MS)对酿造酱油、酸水解植物蛋白调味液、酱油香精及焦糖色素的挥发性组分进行检测分析，筛选出各自的特征差异组分，寻找能有效鉴别酿造酱油与非酿造酱油的指标，完善目前酿造酱油与非酿造酱油鉴别指标体系，建立酿造酱油和非酿造酱油鉴别检验方法。酿造酱油中特征组分有乙醇、异戊醇、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇等醇类物质，即酿造酱油中还原性挥发性组分较多，而且发现1-辛烯-3-醇是区别酸水解植物蛋白调味液、酱油香精及焦糖的特征差异性组分。实验中对30个酱油样品进行属性判定，检测结果分析发现国内酱油生产掺假严重。

邓岳等[15]用HS-SPME-GC-MS对“非物质文化遗产”——四川省泸州市合江县先市酱油香味物质进行分析，共检测出67种挥发性香味物质，其中有7种醇、10种醛、6种酮、9种酸、12种酯、5种吡嗪、5种酚、7种呋喃、4种含硫化合物及2种其他类挥发性物质，其中酸类物质含量最高，其次为醇类、酚类、呋喃类、醛类、酯类、吡嗪类、含硫类、酮类。实验可为后期优化先市酱油生产工艺，提升传统工艺酱油风味提供一定的指导和参考。

丁莉莉等[16]将顶空-固相微萃取技术创新，采用无溶剂萃取检测，结合气相色谱-质谱联用仪，研究中日酱油在模拟蘸料和炒菜条件下挥发性呈香物质的差异。结果显示：在模拟蘸料条件(25 ℃)下，检测到日本酱油(3种酱油样品)呈香酯类物质居多，其含量约是中国酱油(3种酱油样品)的2倍；中国酱油呈香吡嗪类物质居多，是日本酱油的1.6倍。在模拟炒菜条件(95 ℃)下，日本酱油呈香物质种类增加35%，中国酱油增加59%。日本酱油中醇类、酯类和醛类物质表现突出，乙醇为日本酱油的典型呈香物质，赋予其浓厚醇香；中国酱油中吡嗪类、酯类和酮类物质占比较大，赋予其浓郁酱香，苯乙醇为中国酱油的典型呈香物质，赋予一定的花香和果香。

气相色谱法是目前应用于酱油组分及鉴别真假研究中最多的一种方法，其快速、高效、灵敏度高，但是该法需要将样品气化，仅适用于对挥发性成分的分析，对非挥发性成分和很难测定的残留物等爱莫能助。因其仪器比较昂贵、实验成本高且需要专门操作环境，所以并不利于推广普及。

4 液相色谱法

液相色谱检测技术属于食品安全检测中的重要技术，其应用优势集中体现在分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多；分离效能高、灵敏度高，可选择多种新型固定相以达到最佳分离效果；不受样品挥发性和热稳定性的限制，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物，应用范围广，约占80%的有机化合物可用高效液相色谱分析，因此被广泛地运用到食品安全检测中。

低浓度的生物胺能调节生理功能(如体温调节和胃酸分泌)，但高浓度的生物胺对人体健康有害，微生物水解蛋白质是酱油中生物胺的潜在来源[17]。Dong等[18]研究的目的是建立一种新的分析方法，使用改良的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe，是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，由美国农业部Anastassiades教授等于2003年开发的)纯化，然后进行UHPLC-MS/MS分析，确定酱油中的7种生物胺(酪胺、苯乙胺、组胺、色胺、腐胺、精胺和亚精胺)。所提出的方法在线性、准确度、精确度、检测限和定量限方面得到验证。此外，研究者从当地购买20种酱油，验证了实验创建的该方法在商业酱油样品中分析生物胺中的应用，结果显示所有样品中均检测到7个生物胺，浓度在46.2～1422 mg/kg之间。

酱油发酵液中含有丰富的胺基类化合物(肽、氨基酸等)和还原糖(葡萄糖、果糖等)，因而酱油生产酿造过程中发生美拉德反应是不可避免的。Amadori Product(AP)由美拉德反应产生，是酱油颜色、味道、香气的关键决定因素，所以Katayama等[19]采用五氟苯丙基键合硅胶柱的液相色谱-串联质谱法，建立了一种可在酱油中同时定量20种APs且无需离子配对试剂或样品的衍生化方法。经验证，该方法可在10 min内完全分离20种APs，适用于检测6种酱油的总AP水平或个别APs水平，8个样品的总AP水平差异很大，从358 mg/L到24347 mg/L，其中Fru-Lys(N-ε-(1-deoxy-d-fructosyl-1-yl)-l-lysine)和Fru-pGlu(N-(1-deoxy-d-fructosyl-1-yl)-l-pyroglutamic acid)的浓度类似，是这20种AP中最高的。另外，实验还发现6个月的发酵时间对酱油中的AP水平影响较大，但此后保持不变，而热处理对酱油中的AP水平几乎无影响。

Feng等[20]为了在酱油样品中选择性提取4-甲基咪唑(4-MEI)，制备了磁性分子印迹聚合物(MMIP)进行高效液相色谱分析。采用扫描电镜(SEM)、傅里叶变换红外(FT-IR)、X射线衍射(XRD)和振动样品磁强计(VSM)对其进行了表征。该磁性聚合物对目标模板分子具有较好的选择性识别性能和较高的吸附能力。在较短的萃取过程中，达到了吸附和解吸的平衡，萃取后的MMIPs可以通过磁铁快速收集。MMIPs作为酱油中4-甲基咪唑的选择性预浓缩吸附剂，对加药样品的回收率为97%～105%，具有较好的回收率。实验证明，MMIPs在确定酱油样品中的4-MEI方面存在潜在的前景。

氨基甲酸乙酯是一种常存在于豆制品发酵产品中的2A类致癌性化学污染物，有较高的食品安全风险。黄秋婷等[21]建立了一种超高效液相色谱串联四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测酱油类调味品中氨基甲酸乙酯的方法。样品经优化的QuEChERS方法净化后，用高分辨质谱 QExactive进行测定。经试验，该方法快速、高效、环境友好，且无基质效应。采用本研究建立的检测方法对市场流通度较高的9种品牌酱油进行了测定，发现6种酱油检测到了氨基甲酸乙酯，范围在11.98～41.70 μg/kg。

廖敏等[22]建立了一种同时快速测定酱油中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜的高效液相色谱法。本法采用纯水提取样品，简化了样品前处理，加快了分析速度，操作简易，灵敏度高，样品在10～100 mg/kg添加水平范围内，回收率在90%～104%，相对标准偏差均小于3%，证明适合酱油中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜的检测。

近年来，液相色谱法尤其是高效液相色谱法多用于对酱油中非挥发性成分和有毒有害残留物的鉴定，它对被检测物质的活性影响相对比较小，与此同时，并不需要特别对样品进行气化，就可以检测出其中非挥发性物质和很难测定的残留物等。但是，该法预处理较为复杂，加之和气相色谱法一样，其仪器体型大、昂贵且对操作方法和操作环境有很高的要求，需到专门的仪器室检测，不能随测随用。

5 其他技术检测

5.1 感官分析仪器

电子鼻和电子舌能够模仿人类的感官对气味和滋味进行分析处理，具有客观性和重现性，而且相对于气相色谱、质谱等方法，它无需样品前处理，具有操作简便、时间短、成本低、无损样品等优点，已在食用香辛料、调味品、肉制品等食品检测中得到应用，有广阔的发展前景[23-25]。

安莹等[26]采用电子鼻对3种品牌的14个酱油样品进行了检测，得到的数据经过主成分分析，能够完全区分酱油品牌，此研究为酱油品牌检测提供了一个新思路。

曹仲文[27]对3个品牌的6个酱油样品进行了3次平行试验，对电子舌系统得到的数据进行处理后，酱油样品与样品之间、品牌与品牌之间都有明显的区分，说明电子舌对酱油有不错的识别能力。

易宇文等[28]将电子鼻和电子舌的检测信号融合，对8种不同品牌酱油样品进行了检测，分析后发现电子鼻无法区分香气极为相似的样品，电子舌能够区分这8种样品，而两者信号融合后，对酱油综合评价的能力和灵敏度都明显增强。

电子鼻与电子舌虽简便易测，但是检测的灵敏度和精度明显不如气相色谱法和液相色谱法，若要区分更多样品则需要建立庞大的样品数据库，其在检测中可以起到参考作用，但是并不能用于专业分析。

5.2 碳同位素比值质谱法

谭梦茹等[29]先利用元素分析-碳同位素比值质谱法采集了86个酿造酱油的碳同位素比值并建立了数据库，继而对市场上常见的58个标注酿造酱油的样品进行了比对验证，结果发现有15个酱油样品掺假。但是该实验只能鉴别碳-4来源的掺假，无法鉴别碳-3的外源性掺假，有一定的局限性。

5.3 13C核磁共振法

Kamal等[30]采用13C NMR谱结合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等多元统计数据分析方法，研究了不同类型酱油(生抽、老抽、红烧、草菇生抽)的代谢组学差异。在这4种样品中，谷氨酸、蔗糖和葡萄糖是最显著的代谢物，另外，因生抽是原汁原味的酱油，所以它与其他3种酱油也有较大差异。

5.4 介电法

赵佳瑶[31]通过介电谱与化学计量相结合，对不同浓度的酿造酱油进行检测，研究了频率、温度和浓度与酱油的介电常数、损耗因子和穿透深度之间的关系，并找到一种有效而准确的鉴定酿造酱油与配制酱油的方法，经实验验证，该方法具有可行性。

该研究对同一酿造酱油掺入不同浓度的酸水解植物蛋白液进行检测，未对市面上的其他品牌酱油进行验证，实用性有待考究。

6 展望

目前，应用于酱油组分研究的技术方法多种多样，在酿造酱油生产过程中，由于原料的差异及生产工艺的不同，生产出的酿造酱油产品存在一定的差异；另外，酱油产品的掺假物酸水解植物蛋白调味液也存在较大的差异，给研究工作带来了困难。上述有些方法高效可行，但是仪器精贵、成本高昂，不利于普及，另一些方法又没有达到快速、准确、有效的检测效果。将多种技术方法结合，建立一种既灵敏高效，又简单便捷的方法应是研究者追求的目标。