siRNA沉默NUMB表达对胆囊癌细胞NOZ和GBC-SD增殖和转移的影响

2020-08-13蔡炜龙余胜汪伟民楼能

浙江医学 2020年14期

蔡炜龙余胜汪伟民楼能

胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈现升高趋势[1]。胆囊癌早期症状不明显，易与消化道疾病混淆而被忽略，但其进展较快，极易发生局部浸润和远处转移，因此发现时多处于中晚期，患者已失去手术治疗的机会。且胆囊癌对放化疗不敏感，因此预后极差，患者5年生存率低于5%[2-4]，因此亟待寻找胆囊癌早期诊断的靶标。细胞命运决定子NUMB是一种定位于细胞基底层的内吞调配蛋白，参与细胞表面蛋白等的内吞转运过程[5]。研究表明NUMB参与多种肿瘤细胞的增殖、迁移和上皮间质转化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）过程，如结肠癌、卵巢癌等[6-7]，而NUMB对胆囊癌细胞的作用目前尚鲜见报道。因此本研究拟通过观察NUMB对胆囊癌NOZ和GBC-SD细胞增殖和迁移的作用，从而探讨其作为胆囊癌早期诊断靶标的可能性。

1 材料和方法

1.1 实验材料细胞：人胆囊癌细胞NOZ和GBC-SD细胞由上海市胆道疾病研究重点实验室提供。主要试剂：NUMB抗体和兔二抗购自武汉Abclonal有限公司；链霉素-青霉素双抗、达尔伯克改良伊格尔培养液（DMEM）、选择性改良伊格尔培养液（Opti-MEM）、FBS、CCK-8试剂盒、多聚甲醛、结晶紫、BCA蛋白浓度测定试剂盒等购自上海翊圣有限公司。脂质体2000（Lipofectamine2000）购自美国Invitroen公司。si-NUMB和si-NC由上海拓然生物科技有限公司合成。

1.2 细胞培养 NOZ细胞用含10% FBS和1%的链霉素、青霉素的Williams培养基培养，GBC-SD细胞用含10% FBS和1%的链霉素、青霉素的DMEM培养基培养，均放入5% CO2培养箱中37℃恒温培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 分组与转染将培养后的人胆囊癌细胞NOZ和GBC-SD细胞分为实验组（si-NUMB组）和对照组（CTRL组），其中 si-NUMB组细胞转染 si-NUMB，CTRL组细胞转染si-NC。将NOZ和GBC-SD细胞铺于6孔板内，待细胞生长至50%左右时进行转染。转染过程按照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行，即将50 nmol siRNA和6 μl Lipofectamine2000转染试剂加入200 μl Opti-MEM培养基中孵育15 min，加入到6孔板内，用Opti-MEM补足2 ml。转染6 h后，用无抗生素的完全培养基进行换液。待48 h后收集胆囊癌细胞进行后续实验。

1.4 细胞增殖能力检测采用CCK-8法。将转染48 h后的细胞常规消化、离心、重悬后计数，将细胞接种于96孔板中，每孔2×103个细胞，每组设置4个复孔，放入5% CO2培养箱中 37 ℃恒温培养。分别于 0、1、2、3、4、5 d加入20% CCK-8，37℃避光培养2 h后，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度（OD）值来表示细胞增殖能力，并绘制细胞生长曲线。上述实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞迁移能力检测采用Transwell小室实验。将转染48 h的细胞进行消化、离心后，进行计数。在Transwell小室上室内加入200 μl含2×105个细胞的无血清培养基，下室加入500 μl 10%的完全培养基，放入培养箱内恒温培养。48 h后，将Tranwell小室取出，吸走小室内培养基，加入500 μl多聚甲醛室温固定0.5 h，随后加入500 μl结晶紫染色0.5 h。用清水洗净结晶紫，并用棉签拭净水分并晾干，在显微镜下对未迁移的胆囊癌细胞进行拍照计数。上述实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞内NUMB及EMT关键蛋白表达检测采用Western blot法，检测两组细胞内NUMB表达水平及EMT进程中的关键蛋白[锌指蛋白转录因子1（Snail-1）、E-钙黏蛋白（N-cadherin）及 N-钙黏蛋白（E-cadherin）]的表达水平。将转染48 h的细胞进行细胞总蛋白提取。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，并用蛋白上样缓冲液对细胞总蛋白进行煮沸变性。进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，随后转膜。转膜结束后用5%的脱脂牛奶常温封闭1 h以去除非特异性结合。随后一抗4℃孵育过夜，第2天进行二抗常温孵育0.5 h。然后用化学发光仪对蛋白表达情况进行显影、曝光，并采用Image J软件量化Western blot条带灰度值。上述实验重复3次，取平均值。

1.7 统计学处理采用SPSS 22.0统计软件。计量资料用±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞增殖能力比较 NOZ细胞：与CTRL组比较，si-NUMB组的OD值在第2、3、4、5天时均明显为高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；GBC-SD细胞：与CTRL组比较，si-NUMB组的OD值在第3、4、5天时均明显为高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。

2.2 两组细胞迁移能力的比较与CTRL组比较，si-NUMB组NOZ和GBC-SD细胞的迁移细胞数量均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2（插页）和表1。

2.3 两组细胞NUMB及EMT关键蛋白表达水平的比较所有蛋白表达水平比较以GAPDH作为参考。与CTRL组相比，si-NUMB组NOZ和 GBC-SD细胞中NUMB、E-cadherin蛋白表达水平均明显为低，而Snail-1、N-cadherin蛋白表达水平均明显为高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表 2、图 3。

3 讨论

图1 两组细胞吸光度（OD）值的比较

表1 两组细胞穿膜细胞数（个）

图2 两组细胞结晶紫染色所见

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，极易发生转移，恶性程度很高。然而目前对胆囊癌的基础研究较为薄弱，因此寻找胆囊癌早期诊断和治疗的靶标显得尤为重要。NUMB广泛参与多种肿瘤的发生和发展[8]，且其是发现的首个在生物体内多种组织器官中广泛存在的且能够调控不对称细胞分裂的基因，可以参与调控细胞内吞、迁移、黏附、增殖和肿瘤形成等过程[9-10]。现在越来越多的研究关注到NUMB的异常表达对肿瘤发生、发展的作用，且有研究表明NUMB基因在不同肿瘤中的作用并不相同[11-14]。Hu等[11]通过对241对乳腺癌样本进行检测，发现在乳腺癌组织中NUMB表达明显减少，且NUMB的表达降低与乳腺癌的不良预后有关，提示在乳腺癌中NUMB具有抑制肿瘤生长的作用。Flores等[12]发现在膀胱癌中NUMB表达明显降低，其可能通过细胞凋亡因子p53、细胞周期素D1和Ras相关C3肉毒素底1、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达抑制膀胱癌细胞的增殖及转移能力。Liang等[13]发现NUMB可以通过p-21活化酶1（PAK1）/β-连环蛋白信号通路抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和EMT过程。然而，Siddique等[14]发现在肝癌组织中NUMB基因明显高表达，且与肝癌的预后明显相关，提示NUMB能够促进肝癌细胞的生长。这些研究均表明NUMB可能作为恶性肿瘤的生物标志物。

本研究主要关注于NUMB基因对胆囊癌细胞增殖和转移能力的影响。本研究团队应用RNA干扰技术在胆囊癌NOZ和GBC-SD细胞中敲低NUMB的表达。并通过CCK-8实验检测NUMB对NOZ和GBC-SD细胞增殖能力的影响，结果发现与对照组相比，敲低NUMB后胆囊癌NOZ和GBC-SD细胞的增殖能力明显升高。通过Transwell小室实验检测NUMB对NOZ和GBC-SD细胞迁移能力的影响，结果发现与对照组相比，敲低NUMB后胆囊癌NOZ和GBC-SD细胞的迁移能力明显升高。综上，表明NUMB可能通过影响胆囊癌细胞的增殖和迁移能力从而抑制胆囊癌的发生、发展。

EMT与肿瘤细胞的迁移和侵袭有关，是肿瘤进展的关键因素，通常表现为上皮细胞标志物（如E-cadherin和细胞角蛋白）的丢失和间质细胞标志物（如波形蛋白、N-cadherin和纤维连接蛋白）的增加[15-16]。本研究中，笔者发现NUMB能够抑制胆囊癌细胞的迁移能力，同时笔者通过Western blot实验检测其EMT相关蛋白分子的变化，发现敲低NUMB后胆囊癌NOZ和GBC-SD细胞中Snail-1和N-cadherin表达明显升高，E-cadherin表达明显减少，说明沉默NUMB蛋白的表达可以诱导EMT的发生，促进肿瘤细胞的转移。这些结果均表明NUMB参与了胆囊癌细胞的转移过程。