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miR-150和HMGA2在结直肠癌中的表达和临床意义

2020-08-13张忠臣吴丽丽王国平

浙江医学 2020年14期
关键词:细胞周期直肠癌活性

张忠臣 吴丽丽 王国平

结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤,发病率高,尤其近年来在青年中发病率呈增高趋势[1]。高迁移率蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)是高迁移率蛋白A(因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速度快而得名[2])家族成员之一,它可通过改变染色体结构或与其他转录因子相互作用,参与多种生物学过程,调控基因的转录和表达,包括调控细胞增殖和凋亡。除胚胎早期和未分化组织外,它在正常组织中含量较低。多种研究表明HMGA2异常表达与乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌及卵巢癌等多种肿瘤的发生、进展及预后密切相关[3-6],在结直肠癌的研究中也发现HMGA2表达异常,可能与疾病的进展和预后有关[7]。miRNA(miR)是一种重要的表观遗传调控因子,它通过抑制mRNA的翻译或降解mRNA来影响细胞增殖周期及凋亡。越来越多的证据表明miR的异常表达在结直肠癌发生、发展中起着至关重要的作用[8-11]。生物信息学分析显示miR-150与HMGA2的3′-端非翻译区(3′-UTR)基因序列具有靶向互补关系。本研究探讨miR-150和HMGA2在结直肠癌细胞增殖周期中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 人结直肠癌SW480细胞株和正常结肠上皮细胞(FHC)均购自上海珍妮生物技术公司;细胞培养基(RPMI 1640)、减血清培养基(Opti-MEM)、杜氏培养基(DMEM)、FBS和青链霉素均购自以色列生物有限公司;脂质体RNA iMAX转染剂购自美国皮尔斯公司;逆转录酶定量PCR、逆转录试剂盒和SYBR Green染料均购自日本大阪东洋生物公司;HMGA2小干扰RNA购自上海基因制药有限公司;miR核苷酸片段购自广州瑞博生物有限公司;HMGA2兔抗人抗体购自美国CST公司;小鼠抗细胞周期蛋白A抗体购自美国圣克鲁斯生物科技公司;山羊抗兔抗体IgG(H+L)购自美国剑桥Abcam生物技术公司;过氧化酶标记抗鼠兔二抗购自美国杰克逊免疫研究所;细胞计数试剂盒8(CCK-8)购自武汉博士德公司;TRIZOL试剂、人胚肾细胞(HEK293T)及细胞周期检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司;荧光素酶基因载体pLUC购自美国奥斯汀Ambion公司。

1.2 细胞分组和转染 将人结直肠癌SW480细胞和FHC分别分为SW480细胞组和FHC组。FHC在DMEM中培养,SW480细胞于添加10% FBS、1%青链霉素的RPMI 1640中培养,SW480细胞呈对数生长期时,将细胞铺至6孔板,贴壁24 h后将SW480细胞分为miR-150对照组、miR-150模拟体组、小干扰对照组、小干扰HMGA2组和miR-150模拟体联合小干扰HMGA2组共5组。miR-150模拟体组细胞转染miR-150模拟体;小干扰对照组细胞转染小分子干扰RNA序列(正链:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,负链:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′);小干扰 HMGA2组细胞转染HMGA2特异性siRNA序列(正链:5′-CAGCCUGAAUAACUUGAACTT-3′,负链:5′-GUUCAAGUUAUUCAGGCUGTT-3′);miR-150模拟体联合小干扰 HMGA2组细胞共转染miR-150模拟体及HMGA2特异性siRNA序列。转染时采用Opti-MEM培养液分别稀释核苷酸片段和脂质体RNAiMAX转染剂,在室温下培养5 min后,将它们混合并添加到细胞中,48 h后收集细胞进行检测。

1.3 SW480细胞组和FHC组miR-150、HMGA2和周期蛋白A(Cyclin A)表达水平检测 用Trizol试剂提取总RNA并采用RT-PCR法进行检测,所使用的引物如下:miR-150PF:5′-ATAAAGTGCTGACAGTGCAGATAGTG-3′;miR-150PR:5′-TCAAGTACCCACAGTGCGGT-3′;U6PF:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′;U6PR:5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′;HMGA2PF:5′-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3′;HMGA2PR:5′-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3′;CyclinAPF:5′-ACATGGATGAACTAGAGCAGGG-3′;CyclinAPR:5′-GAGTGTGCCGGTGTCTACTT-3′;β-actinPF:5′-GAACCCTAAGGCCAAC-3′;β-actinPR:5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。RT-PCR反应体系包括2×SYBR Green RT-PCR预混液10 μl,上下游引物(10 μm/l)各 0.8 μl,2 μg 互补 DNA和蒸馏水,分别在ABI7500上进行95℃15 s、60℃30 s、74℃30 s 40个循环的PCR反应,然后用凝胶电泳法检测SW480细胞组和FHC组miR-150、HMGA2和Cyclin A的表达水平。

1.4 miR-150对照组和miR-150模拟体组HEK293T荧光活性的检测 采用荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光活性。生物信息学分析显示miR-150与HMGA2的3′-UTR基因序列具有靶向互补关系,取适量对数生长期的SW480细胞,提取细胞总RNA,逆转录cDNA,以cDNA为模板,根据HMGA2的编码序列设计含有EcoR1和BamH1限制性内切酶位点的引物序列,通过PCR反应扩增并回收HMGA2编码片段,将含有HMGA2-3′-UTR全长片段的PCR产物连接到pLUC质粒DNA并将基因转化成DH5α细胞,质粒经测序确认并分别命名为pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型和pLUC-HMGA2-3′-UTR-突变型,再用脂质体RNA i-MAX 转染剂将 pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型、pLUCHMGA2-3′-突变型分别和miR-150模拟体共转染HEK293T,培养48 h后,按说明书使用双荧光素酶报告基因检测系统检测两组HEK293T的荧光活性。

1.5 5组转染细胞G0/G1、G2/M、S期细胞比例的检测 采用碘化丙啶染色法的流式细胞术。用酶收集细胞并转移到15 ml离心管中,先以1 000 r/min离心5 min,再将细胞用70%乙醇固定后4℃下过夜,之后添加50 μg/ml碘化丙啶在37℃避光保存15 min,按上述处理后采用流式细胞仪检测样品。

1.6 5组转染细胞的细胞活力检测 采用CCK-8法。用96孔板细胞接种,每孔104细胞。培养48 h后,每孔添加10 μl CCK-8溶液,4 h后用微平板光扫描仪在450 nm波长处测定其吸光度(OD),OD值可反映细胞密度,根据OD值绘制细胞细胞生长曲线。

1.7 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料用±s表示,两组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SW480细胞组与 FHC组 miR-150、HMGA2和Cyclin A表达水平比较 SW480细胞组较FHC组miR-150表达水平下降,而HMGA2和Cyclin A表达水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

表1 SW480细胞组与FHC组miR-150、HMGA2和Cyclin A表达水平比较

2.2 miR-150对照组和miR-150模拟体组HEK293T荧光活性的比较 与miR-150对照组比较,miR-150模拟体组pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型HEK293T荧光活性明显为低,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.3 5组转染细胞G0/G1、G2/M、S期细胞比例的比较 与miR-150对照组比较,miR-150模拟体组、小干扰HMGA2组和miR-150模拟体联合小干扰HMGA2组G0/G1期细胞比例均明显为高,而G2/M、S期细胞比例均明显为低,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表3。

表2 miR-150对照组和miR-150模拟体组人胚肾细胞荧光活性的比较

表3 5组转染细胞G0/G1、G2/M、S期细胞比例的比较

2.4 5组转染细胞的细胞活力比较 与miR-150对照组及小干扰对照组比较,miR-150模拟体组、小干扰HMGA2组、miR-150模拟体组联合小干扰HMGA2组的OD值均减弱,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图1。

图1 5组转染细胞的细胞活力比较

3 讨论

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤,年发病率高达28.2/10万,病死率为13.61/10万,每年新发38.8万例,病死18.7万例[12]。此外,结直肠癌预后较差,3年生存率约为60%,5年生存率低于40%,因此寻找结直肠癌发病机制中的分子靶点对早期诊断和预后具有重要意义。

HMGA2是一种无转录活性的非组蛋白染色体蛋白,它可以通过改变染色体的空间结构或与蛋白质相互作用来调控基因转录、复制和修复DNA损伤[13]。Cyclin A是细胞周期的正向调控因子,能与细胞周期素依赖性激酶1、细胞周期素依赖性激酶2相互作用,促进细胞进入S期,加速G2/M相变,在细胞周期中起着至关重要的作用。Leung等[14]发现HMGA2的过度表达常在恶性肿瘤中出现,主要在包括结直肠癌在内的胃肠道肿瘤中过表达。有研究表明,miR-150表达降低与结直肠癌发生相关,并可能影响结直肠癌进展[11]。生物信息学分析显示miR-150与HMGA2的3′-UTR具有互补的靶向关系。因此本研究旨在探讨miR-150在调控HMGA2表达及对结直肠癌细胞增殖的影响。

本研究显示,与FHC组相比,SW480细胞组HMGA2表达水平升高,而miR-150表达水平下降。有研究表明,HMGA2在结直肠癌组织中异常上调与肿瘤分期、远处转移及预后不良有关[15-16],本研究发现在结直肠癌组织中HMGA2升高,与其结果一致。Gattolliat等[17]报道miR-150在结肠腺瘤或结直肠癌组织中的表达水平明显低于正常结肠黏膜,Ma等[18]发现结直肠癌组织中miR-150表达水平较邻近正常组织明显降低,且miR-150表达水平较低的患者生存率更低,化疗敏感性更差。本研究发现SW480细胞组中miR-150表达水平下降,与上述结果一致。与FHC组比较,在SW480细胞组中miR-150表达水平明显下降,而HMGA2和Cyclin A表达水平升高,这表明下调miR-150表达水平可能上调HMGA2和Cyclin A表达水平,并进一步促进结直肠癌细胞增殖,加快细胞周期。本研究进一步分析表明,miR-150模拟体和(或)小干扰HMGA2阻滞细胞周期G0/G1期,抑制SW480细胞增殖。Wu等[19]研究表明,HMGA2过表达明显促进了结直肠癌细胞的侵袭和转移,而HMGA2的表达下调则表现出相反的作用。本研究也表明HMGA2表达下调可降低结直肠癌细胞的恶性特征。

综上所述,本研究显示miR-150可通过抑制HMGA2及Cyclin A的表达,诱导结直肠癌细胞周期阻滞,抑制细胞增殖。

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