microRNA在胆囊癌中的作用

成亚飞， 王 斌， 王世明

1 山西医科大学 研究生院， 太原 030001； 2 山西医科大学第一医院 肝胆胰外科， 太原 030001

胆囊癌是最常见的胆道系统恶性肿瘤，占胆道系统恶性肿瘤的80%～85%[1]，发病率在消化道肿瘤中排第6位[2]。根治性手术切除是临床治愈胆囊癌的唯一方式，但因其具有发病隐匿、临床症状不典型、早期诊断率较低等特点[3]，导致临床80%以上的患者诊断时已属中晚期，手术治疗效果不容乐观。虽然辅助放疗、化疗等[4]治疗方式对胆囊癌有一定帮助，但患者总体预后仍较差，5年生存率不足5%[5]。因此，提高对胆囊癌的早期诊断及治疗效果显得尤为重要。近些年随着对microRNA(miRNA)在肿瘤中作用的研究逐渐增多，发现其在胆囊癌的发生、发展、预后、化疗耐药、早期诊断中扮演了重要的角色[6]，为胆囊癌早期诊断及治疗提供了新的方向。

1 miRNA的概述

miRNA是一类广泛存在于真核生物体内的内源性非编码小分子RNA。成熟的miRNA由20～25个核苷酸序列组成，其形成过程包括以下几点：(1)首先在细胞核中，在RNA聚合酶Ⅱ作用下形成较长的具有茎-环结构的pri-miRNA；(2)pri-miRNA在RNaseⅢ Drosha酶作用下形成核苷酸序列为60～70个具有发夹结构的pre-miRNA；(3)pre-miRNA被转运蛋白Exportin-5转运至细胞质；(4)在细胞质中，pre-miRNA在RNaseⅢ Dicer酶作用下形成20～25个核苷酸序列的双链miRNA；(5)双链miRNA在解螺旋酶的催化下形成两条单链miRNA，其中一条被降解，另一条成为成熟的miRNA[7]。成熟的miRNA通过碱基互补配对原则与mRNA 3′-UTR非特异性结合，进而抑制mRNA转录后翻译或导致mRNA转录后降解，由此调节转录后基因水平的表达，广泛参与了真核生物细胞、组织的生长发育、衰老、死亡等过程[8]。

2 在胆囊癌中发挥促癌作用的miRNA

2.1 miRNA-182 Qiu等[9]研究发现，与正常胆囊组织相比，胆囊癌组织中miRNA-182水平显著升高；与非转移胆囊癌组织相比，转移的原发胆囊癌组织中miRNA-182的表达亦明显升高。此外还证实TGFβ可诱导胆囊癌细胞miRNA-182的表达，在阻断miRNA-182的表达后，TGFβ诱导癌细胞迁移和侵袭的作用减弱，并且有效抑制了体内肺转移。进一步研究发现，细胞黏附分子1(CADM1)是miRNA-182的靶基因，CADM1的表达水平与miRNA-182呈负相关，在胆囊癌细胞中CADM1的重新表达减弱了miRNA-182诱导的细胞侵袭。这些结果表明TGFβ介导的miRNA-182/CADM1轴的激活在胆囊癌的迁移和侵袭中发挥了重要作用，miRNA-182高表达可作为胆囊癌侵袭和迁移的潜在标志物，并且有望成为胆囊癌治疗的一个潜在分子靶点。

2.2 miRNA-181b-3p 上皮细胞-间充质转化(epithelial-tomesenchymal transition, EMT)被认为是肿瘤发生侵袭转移的重要原因[10]。E-钙黏蛋白等细胞黏附分子表达的减少以及细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架是EMT过程的显著特征[11]。何政等[12]研究显示，与胆囊癌旁正常组织内miRNA-181b-3p的表达相比，胆囊癌中miRNA-181b-3p表达上调。体外细胞学研究证实过表达的miRNA-181b-3p促进了胆囊癌的侵袭转移，而下调则降低了胆囊癌的侵袭转移能力；进一步研究发现在胆囊癌细胞中miRNA-181b-3p与E-钙黏蛋白呈负相关。基于以上研究提示，miRNA-181b-3p促进胆囊癌的侵袭转移可能通过促进EMT过程而实现。

2.3 miRNA-20a Chang等[13]通过高内涵筛选，从880个miRNA中筛选出17个胆囊癌主要转移诱导因子；在临床病例随访中发现，miRNA-20a表达上调与局部浸润、远处转移及预后不良密切相关，miRNA-20a高表达组的总生存期低于低表达组。随后其采用RT-PCR、免疫印迹、免疫组化、原位杂交等方法对miRNA-20a的生物学功能进行了深入的研究，结果证实：(1)miRNA-20a水平升高与胆囊癌细胞TGFβ1水平升高有关；(2)miRNA-20a的异位表达可直接靶向Smad7的3′-UTR，促进β-连环蛋白(β-catenin)的核移位，诱导胆囊癌细胞在体内外的EMT过程，从而促进胆囊癌细胞的增殖和侵袭；相反，阻断miRNA-20a的表达能有效地恢复Smad7的表达，减弱TGFβ1诱导的细胞转移。该研究结果表明，TGFβ1介导的miRNA-20a/Smad7/β-catenin轴的激活在胆囊癌的发病机制和预后方面起着关键性的作用。

2.4 miRNA-155 大量研究[14-16]表明，miRNA-155在人多种实体肿瘤中起到了原癌基因的作用，胆囊癌也不例外。Kono等[17]发现，miRNA-155的高表达与胆囊癌的侵袭行为有关，阻断miRNA-155表达，则使得胆囊癌细胞增殖和侵袭性减弱。在胆囊癌miRNA-155表达水平与临床病理特征关系的研究[18]中发现，miRNA-155的高表达与TNM分期、淋巴结状态、肝转移、分化程度显著相关。Kaplan-Meier生存分析表明，高表达miRNA-155的胆囊癌患者5年生存率明显低于低表达者。这些发现均提示miRNA-155在胆囊癌发展过程中起到了促进作用，对miRNA-155水平的调节可能会被应用于胆囊癌的治疗，故其可作为判断胆囊癌预后的预测因子及治疗靶标。

3 在胆囊癌中发挥抑癌作用的miRNA

3.1 miRNA-34a miRNA-34a在人多种肿瘤中表达下调。Jin等[19]研究发现与正常胆囊组织相比，胆囊癌组织miRNA-34a表达明显下调，端粒长度延长。在CD44+CD133+胆囊癌干细胞和异种移植瘤模型中，注射腺病毒介导的miRNA-34a可抑制CD44+CD133+胆囊癌干细胞体外集落形成能力和异种移植瘤体内生长，并同时降低移植瘤细胞蛋白磷酸酶1核目标亚基(PNUTS)的表达和端粒长度，而在异种移植瘤模型中，PNUTS是一种端粒缩短的蛋白。故miRNA-34a低表达和端粒长是胆囊癌预后不良的标志。

3.2 miRNA-335 Peng等[20]研究发现，miRNA-335在大多数胆囊癌细胞中表达下调，低表达的miRNA-335与胆囊癌的高组织学分级、淋巴结转移阳性、临床分期相关，单因素分析表明，miRNA-335低表达是影响胆囊癌患者总生存率的重要因素，进一步的多因素分析同样证实了上述结果。Fatima等[21]采用Kaplan-Meier生存分析结果显示，miRNA-335低表达显著影响了胆囊癌患者中位生存期(7个月 vs 25个月)。这些结果说明，miRNA-335的表达下调与疾病的严重程度有关，即miRNA-335低表达时可以作为胆囊癌患者预后不良的标志。

3.3 miRNA-135a-5p、miRNA-26a Zhou等[22]首次报道了miRNA-135a-5p、miRNA-26a在胆囊癌组织中下调，并通过应用CCK-8检测方法证实二者下调对胆囊癌细胞增殖有显著影响。另外，miRNA-135a-5p可直接靶向作用于极低密度脂蛋白受体(VLDLR)，进一步研究表明p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路参与miRNA-135a-5p/VLDLR下游信号转导。更重要的是p38抑制剂预处理后，miRNA-135a-5p诱导的对胆囊癌细胞增殖的抑制作用消失。此外miRNA-135a-5p诱导的G1/S期阻滞也可以被p38抑制剂阻断。这些结果提示，miRNA-135a-5p/VLDLR/p38 MAPK轴可能有助于胆囊癌细胞增殖。Zhou等[23]在随后的一项研究中发现，高迁移率蛋白A2 mRNA(HMGA2 mRNA)的3′-UTR是miRNA-26a的直接靶点，高水平miRNA-26a抑制HMGA2的表达，进而抑制胆囊癌细胞增殖，当HMGA2重新表达时，miRNA-26a对胆囊癌细胞增殖的抑制作用则减弱。以上研究表明，miRNA-135a-5p、miRNA-26a有望成为胆囊癌患者的预后参考因素和治疗靶点。

3.4 miRNA-146b-5p Cai等[24]研究表明miRNA-146b-5p的表达水平与肿瘤大小和发展密切相关，与胆囊癌旁正常组织相比，miRNA-146b-5p在胆囊癌组织中的表达明显降低。miRNA-146b-5p在SGC-996人胆囊癌细胞中的过表达通过增强细胞凋亡和G1期阻滞抑制细胞生长。此外，表皮生长因子受体(EGFR)的强表达逆转了miRNA-146b-5p的增殖抑制能力，提示EGFR是miRNA-146b-5p在胆囊癌中的生物学效应介导因子。Lv等[25]收集了150对胆囊癌患者及周围正常组织标本，通过检测发现，与邻近正常组织相比，miRNA-146b-5p在胆囊癌组织中的表达降低，采用Kaplan-Meier生存分析显示，miRNA-146b-5p高表达的胆囊癌患者总体生存率高于miRNA-146b-5p低表达的患者。在进一步的单因素和多因素分析中证实miRNA-146b-5p的表达增加是胆囊癌患者预后良好的独立预测指标。

3.5 miRNA-218-5p 结肠癌相关转录因子1(CCAT-1)是一种长链非编码RNA，该基因除了在结肠癌中高表达外，在其他实体瘤中也可表达上调，如胆囊癌[26]。Ma等[27]在研究中发现高表达的CCAT-1可通过充当“miRNA海绵”降低miRNA-218-5p有效性，干扰miRNA-218-5p介导靶基因Bmi-1基因下调，进而促进胆囊癌细胞的增殖和侵袭能力。以上结果提示，在胆囊癌中CCAT-1的促癌作用可能部分是通过负向调控miRNA-218-5p而实现，二者可作为胆囊癌治疗的靶标。

3.6 miRNA-145-5p miRNA-145-5p在人多种肿瘤中表达异常。研究[28]发现，与正常胆囊组织相比，胆囊癌中miRNA-145-5p表达明显降低。在体外细胞学研究证实miRNA-145-5p的过度表达显著降低了细胞增殖和菌落形成。miRNA-145-5p在胆囊癌细胞中特异性地激活了信号转导和转录激活因子1(STAT1)，通过对转染miRNA-145-5p-mimics细胞的基因表达分析显示，STAT1信号通路的激活主要是抑癌作用。故miRNA-145-5p通过激活STAT1而影响胆囊癌的相关特性。

3.7 miRNA-139-5p Chen等[29]研究发现miRNA-139-5p在胆囊癌中异常下调，miR-139-5p的低表达与不良临床结局显著相关。miRNA-139-5p的过度表达可抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭。体外实验证实丙酮酸激酶M2(PKM2)是miRNA-139-5p的直接靶点。另外，在异种移植小鼠模型中，miRNA-139-5p的过度表达可直接抑制PKM2的表达，进而导致葡萄糖消耗、乳酸生成和抑制细胞ATP水平。进一步研究发现PKM2在胆囊癌中经常上调，与预后不良相关。这些结果表明，miRNA-139-5p在胆囊癌中通过靶向作用于PKM2发挥抗癌作用，可作为胆囊癌预后预测因子和治疗靶标。

3.8 miRNA-143-3p 血管生成对恶性肿瘤的发生、发展起着关键作用，不仅可以为肿瘤的生长提供充足的养分，还可以促进肿瘤的转移[30]。Jin等[31]研究发现，与肿瘤邻近正常组织相比，miRNA-143-3p在胆囊癌组织中表达水平有所下降。过表达的miRNA-143-3p在体内外抑制了肿瘤血管的生成。进一步研究显示，整合素α6(ITGA6)是miRNA-143-3p的直接靶基因，而过表达miRNA-143-3p后，胎盘生长因子(PLGF)表达明显下调。以上结果表明，miRNA-143-3p通过ITGA6/PLGF途径影响肿瘤血管生成进而影响胆囊癌生长，故miRNA-143-3p可能成为一种新的胆囊癌分子治疗靶点。

3.9 miRNA-29c-5p、miRNA-29c-3p Shu等[32]证实miRNA-29c-5p在胆囊癌中的表达明显下调，并与淋巴结转移密切相关。在体外实验证实，miRNA-29c-5p的异位表达显著抑制肿瘤的增殖、转移、集落形成和诱导细胞凋亡。进一步研究发现，胞质多聚腺苷酸化原件组合蛋白4(CPEB4)是miRNA-29c-5p的一个关键效应靶点，miRNA-29c-5p的强表达显著抑制了CPEB4的表达，通过影响MAPK途径，从而抑制胆囊癌细胞增殖和转移；相反，CPEB4的恢复逆转了miRNA-29c-5p抑制作用。此外，TGFβ可下调miRNA-29c-5p的表达。因此，TGFβ/miRNA-29c-5p/CPEB4/MAPK轴在胆囊癌的发病机制和预后方面具有重要作用，提示miRNA-29c-5p可作为胆囊癌的潜在预后标志物或治疗靶点。有研究[33]发现miRNA-29c-3p在胆囊癌中表达下调，更为重要的是，上调miRNA-29c-3p逆转了胆囊癌细胞EMT过程，进而抑制胆囊癌细胞的侵袭转移。故在胆囊癌中，miRNA-29c-3p作为一种抑癌基因影响胆囊癌侵袭转移。

3.10 miRNA-33a 慢性胆囊炎被公认为是胆囊癌的发病因素。流行病学资料显示，慢性炎症可能是肿瘤发生的重要因素，有报道[34]称，大约20%的恶性肿瘤与慢性炎症有关。Zhang等[35]研究发现炎性细胞因子IL-6在体内外均促进胆囊癌的增殖、迁移、侵袭和EMT。在胆囊癌所有miRNA谱改变的miRNA中，IL-6处理的胆囊癌细胞株和胆囊癌组织中miRNA-33a的表达均显著低于病例对照正常组织和胆囊炎组织。在移植瘤模型中，过表达的miRNA-33a抑制了瘤细胞的生长和扩散。进一步研究发现，miRNA-33a通过直接结合Twist基因抑制IL-6诱导的肿瘤转移。故在胆囊癌中，miRNA-33a是一种抑癌miRNA，可被炎性细胞因子IL-6下调，能作为胆囊炎进展为胆囊癌潜在的风险指标。

4 与胆囊癌化疗敏感性相关的miRNA

4.1 miRNA-125b-5p Yang等[36]研究发现，在顺铂存在情况下，上调miRNA-125b-5p可促进胆囊癌细胞死亡。相反，miRNA-125b-5p的敲除降低了顺铂治疗胆囊癌的细胞死亡。miRNA-125b-5p的上调与顺铂联合可显著抑制小鼠肿瘤的生长。另外，研究中还发现B淋巴细胞-2基因(Bcl-2)是miRNA-125b-5p的直接靶点。临床上胆囊癌中miRNA-125b-5p表达与Bcl-2表达呈负相关。此外，miRNA-125b-5p低表达或Bcl-2高表达与预后不良相关。以上研究表明，miRNA-125b-5p是一种有效的化疗增敏剂，有望成为胆囊癌患者治疗靶点及预测化疗效果和预后的一个新的生物标志物。

4.2 miRNA-31 研究[37]显示，miRNA-31的异位高表达降低了顺铂耐药细胞增殖、活力和侵袭能力，促进了细胞凋亡。在异种移植瘤模型中，miRNA-31在顺铂耐药的胆囊癌细胞中显著降低。以上结果提示，miRNA-31表达上调可增强顺铂化疗敏感性，具有克服胆囊癌耐药的治疗潜力。

4.3 miRNA-145 miRNA-145在胆囊癌中是一种抑癌基因，miRNA-145的异位表达显著影响细胞活力及集落形成，降低血管内皮生长因子A和AXL的基因表达[38]。Zhan等[39]研究表明，miRNA-145过表达增加了顺铂的疗效。miRNA-145通过直接靶向其3′-UTR加速多药耐药相关蛋白mRNA(MRP1 mRNA)的降解，并因此导致胆囊癌细胞中顺铂毒性增加。故低miRNA-145和高MRP1表达水平预示着接受化疗的胆囊癌患者预后不良。这些结果表明，miRNA-145在胆囊癌中发挥抗癌作用，并可作为顺铂化疗疗效的生物标志物。

5 与胆囊癌诊断相关的miRNA

胆囊癌患者确诊时多为中晚期，往往已失去行根治性手术机会，因此寻找特异的诊断胆囊癌的肿瘤标志物成为胆囊癌研究热点。miRNA存在于人类体液中，其物理性状非常稳定，能够抵抗核糖核酸酶的降解，并且耐酸、耐碱，不受温度变化及时间影响[40]，更重要的是，miRNA差异性的表达谱可以用于识别人类肿瘤的诊断、分期、预后及治疗反应[41]。Li等[42]在胆囊癌患者血浆中检测出6个与健康人群差异表达的miRNA，分别为let-7a、miRNA-21、miRNA-187、miRNA-143、miRNA-202和miRNA-335，另外发现miRNA-187、miRNA-143、miRNA-202与胆囊癌临床病理特征有关。这些差异表达有可能为胆囊癌的诊断提供重大意义。另有报道[43]称，miRNA-182在胆囊癌患者血清中表达升高，且通过联合癌胚抗原153检测提高了胆囊癌的诊断效能。通过上述研究可以看出，miRNA在人的体液中稳定存在，并且在胆囊癌患者体液中存在特异性改变，故体液中miRNA检测有望成为一种胆囊癌早期诊断的新的生物学标志物。

6 总结与展望

miRNA影响胆囊癌发生、发展、预后、化疗耐药及诊断，在胆囊癌中有很好的研究前景，其有望成为胆囊癌诊断、预测预后的新的生物学标志物，同时也为抗肿瘤药物的研制提供了新思路和新靶标。但目前miRNA对于胆囊癌的作用仍仅限于基础研究。此外，miRNA相互之间复杂的分子机制及相关通路尚未完全了解，从而限制了临床上的应用。上述问题将是以后研究的重点。随着对miRNA研究的不断深入，相信其在胆囊癌诊断及治疗中将会有广泛的应用前景。