高效液相色谱-蒸发光散射法测定鹅去氧胆酸及杂质熊去氧胆酸含量*

蔡 明，徐 倩，乔金为，鲍学梅，韩 岚，彭代银△

（1. 安徽中医药大学第二附属医院药学部，安徽 合肥 230001； 2. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012）

鹅去氧胆酸（CDCA）又称3α，7α-二羟基-5-β-胆烷酸，是从胆汁中提取的一种天然产物，具有降低胆固醇分泌、增加胆汁分泌、平喘、抗炎、免疫调节等功效［1-3］。目前，其临床主要用于胆固醇型结石的治疗［4-5］。其主要杂质为熊去氧胆酸（UDCA）。2015年版《中国药典（一部）》中，以酚酞为指示剂，以氢氧化钠为滴定液的酸碱滴定法可用于测定CDCA 或UDCA 原料药含量，操作简单，对仪器要求低，分析快捷，但专一性差，精密度低［6］。薄层扫描法也是CDCA 和UDCA 原料药含量测定的常用方法，进样量在0.598 ～3.588 μg 范围内与峰面积线性关系良好，操作简单、专属性强，但精密度低［7-8］。由于CDCA 和UDCA 结构中共轭体系少，仅末端有紫外吸收，故不能采用常规的高效液相色谱（HPLC）法检测器测定CDCA 或UDCA 的含量［9-11］，需通过柱前衍生引入紫外吸收基团，该方法衍生物稳定，灵敏度高，但操作烦琐［12］。本研究中建立了测定CDCA原料药含量及杂质UDCA 的高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）法，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪，包括自动进样器、柱温箱、UV 检测器等（安捷伦科技＜中国＞有限公司）；ELSD-UM-3000 型蒸发光散射检测器（徐州华纳精密仪器有限公司）；AUW120D 型分析天平（岛津企业管理＜中国＞有限公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

鹅去氧胆酸原料药（佛山信航生物科技有限公司，批号分别为CDCA-170402，CDCA-170404，CDCA-170406，纯度为95.0%）；鹅去氧胆酸对照品（批号为110806-201708，纯度为97.0%），熊去氧胆酸对照品（批号为110755-201704，纯度为98.0%），均购自中国食品药品检定研究院；水为双蒸水，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填充C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.10%甲酸溶液（58 ∶10 ∶32，V/ V/ V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；ELSD 漂移管温度：90 ℃；载气（N2）流速：2.6 L/min；进样量：30 μL。

2.2 溶液制备

取鹅去氧胆酸原料药50 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加稀释剂乙腈-水（40 ∶60，V/ V）至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取20 mg CDCA 或20 mg UDCA 对照品，精密称定，分别置10 mL 容量瓶中，分别加乙腈-水（40 ∶60，V/ V）稀释至刻度，摇匀，即得CDCA 对照品溶液或UDCA 对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取供试品溶液、CDCA 对照品溶液、UDCA 对照品溶液、空白溶剂，按拟订色谱条件进样测定。结果，空白溶剂无干扰，各成分的分离度均不小于1.5，理论板数不小于15 000，原料CDCA、杂质UDCA 等分离度均良好，拖尾因子均小于1.10。色谱图见图1。

线性关系考察：精密量取2.2 项下CDCA 或UDCA对照品溶液0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005 mL，分别置1 mL 棕色容量瓶中，加乙腈-水（40 ∶60，V/ V）稀释至刻度，摇匀，得系列标准液。按拟订色谱条件对系列标准液进样，得HPLC-ELSD 图谱，测定峰面积。分别以CDCA 或UDCA 的进样质量浓度的对数值（X）为横坐标、峰面积的对数值（Y）为纵坐标进行线性回归，得鹅去氧胆酸线性回归方程为Y鹅=1.415 8X鹅+3.551 9，R2=0.989 6，线性范围为1.0 ～100.5 μg/mL；熊去氧胆酸线性回归方程为Y熊=1.363 6X熊+3.504 4，R2=0.994 4，线性范围1.0 ～103.2 μg/mL。

检测限（LOD）、定量限（LOQ）确定：精密量取2.2 项下CDCA 或UDCA 对照品溶液适量，配比稀释，按拟订色谱条件进样，分别以信噪比（S/ N）为3 ∶1 和10 ∶1 计算LOD 和LOQ。结果鹅去氧胆酸的LOD 为0.45 μg/mL，LOQ 为1.52 μg/mL；熊去氧胆酸的LOD 为1.14 μg/mL，LOQ 为3.79 μg/mL。

精密度试验：按拟订色谱条件，在标准曲线浓度范围内，取同一批号的CDCA 对照品溶液与UDCA 对照溶液，重复进样6 次，测定，记录峰面积。结果UDCA 峰面积的RSD为0.27%（n=6），UDCA 峰面积的RSD为1.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取鹅去氧胆酸原料药（批号为CDCA-170402），依法制备CDCA 供试品溶液，于0，2，4，6，8，10 h 时进样测定。结果CDCA 和UDCA 的峰面积积分值的RSD分别为1.05%和1.98%（n=6），表明供试品溶液在10 h 内稳定。

重复性试验：取鹅去氧胆酸原料药（批号为CDCA-170402）6 份，依法制备供试品溶液，重复进样6 次，测定。结果CDCA 平均质量含量和RSD分别为97.47%和0.12%（n=6），UDCA 平均质量含量和RSD分别为0.16%和1.57%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批已知含量的CDCA 和UDCA鹅去氧胆酸原料药（批号为CDCA-170402）各9 份。分别加入CDCA 和UDCA 对照品适量，用乙腈溶解，加乙腈-水（40∶60，V/ V）稀释成25mL，按拟订色谱条件进样测定，记录图谱，以外标法测定物质含量，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

精密量取2.2 项下供试品溶液、CDCA 对照品溶液、UDCA 对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定，采用外标法测定物质含量及其他杂质峰，结果见表2。

图1 高效液相色谱-蒸发光散射图谱

表1 加样回收试验结果（n=9）

表2 样品含量测定结果（%，n=6）

3 讨论

鹅去氧胆酸胶囊为临床常用利胆药，主要用于治疗胆固醇性胆结石，其主要成分为鹅去氧胆酸。鹅去氧胆酸结构较复杂，合成步骤较多。因此，鹅去氧胆酸胶囊中难免会引入微量杂质，如熊去氧胆酸、胆石酸等。胆石酸等杂质可能会引发不良反应［13］。因此，控制鹅去氧胆酸胶囊的质量对于减少因临床用药导致的不良反应具有重要意义。

与薄层色谱法、酸碱滴定法相比，HPLC 法准确度和精密度较高，但目前常用的HPLC 法均需柱前衍生处理，操作复杂［14］。RP-HPLC 法可用于熊去氧胆酸胶囊中各成分的含量测定［15］。考虑到去氧胆酸为甾体化合物，无明显的紫外吸收，故HPLC 检测时无法采用常规的紫外检测器。本研究中采用了HPLC-ELSD 法测定鹅去氧胆酸原料药中主成分CDCA 及杂质UDCA 含量。

因CDCA 及杂质UDCA 等分子结构中含有羧基，分子极性较强，且能发生电离，为保证待测组分有足够的C18保留能力，需在流动相中加入一定浓度的改良剂，使所有组分处于游离状态。本研究中考察了不同甲酸体积分数对分析的影响，发现甲酸体积分数在0.05%以上时，对CDCA 和UDCA 峰的保留和各杂质的分离基本无影响，在考察到高酸度对C18色谱柱潜在的影响后，最终选择0.1%甲酸作为本方法的pH 改良剂。进一步考察了水、乙腈、甲醇、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水等极性相对较大溶液与0.1%甲酸混合为流动相对CDCA 原料药各成分的洗脱效果，最终选择乙腈-甲醇-0.10%甲酸溶液（58 ∶10 ∶32，V/ V/ V）体系洗脱，效果好，且噪音小。方法学考察结果显示，该方法系统适用性、重复性均较好，精密度、准确性高，可用于鹅去氧胆酸的质量控制。