中药调控Nrf2 通路发挥肿瘤放射治疗增敏作用的研究进展*

王 松，王 婷，蒋 刚△

（1. 电子科技大学医学院，四川 成都 610054； 2. 四川省肿瘤医院药学部，四川 成都 610041）

Keap1- Nrf2- ARE 是细胞存活的重要防御机制之一，其主要功能是通过诱导多种基因的转录来激活细胞的抗氧化反应，从而抵抗细胞内外的各种损伤，如氧化应激、炎性反应和外来异物的损害［1］。研究发现，Nrf2的激活不仅能提高正常细胞的生存能力，还有助于肿瘤细胞对放化疗的抵抗。肿瘤细胞中Nrf2 的累积可帮助其抵抗化学治疗（简称化疗）和放射治疗（简称放疗）所产生的氧化应激损伤，导致癌症治疗效率下降，甚至导致治疗失败［2］。据报道，肿瘤细胞通过异常激活Nrf2 信号通路实现放疗抵抗［3-5］。目前尚无关于Nrf2 抑制剂在临床使用或正在进行临床试验的相关报道，不过已发现一些中药成分可通过调控Nrf2 达到放疗增敏的效果。本研究中讨论了肿瘤细胞放疗抵抗发生机制及Nrf2 与放疗增敏的关系，同时总结了中药有效成分通过调控Nrf2 通路达到放疗增敏效果的最新研究。

1 肿瘤细胞放疗抵抗的发生机制

放疗抵抗机制的形成通常由多个因素综合导致。肿瘤干细胞内活性氧（ROS）清除剂的上调使得细胞内ROS 浓度降低，导致细胞的DNA 损伤修复能力增强，降低放射敏感性［6］。在放疗抵抗的相关研究中，发现肿瘤细胞内大量出现抗氧化酶过度表达的现象，阻断这些抗氧化防御机制可有效增强放射敏感性，促进肿瘤细胞凋亡［7］。因此，细胞中用于维持其氧化还原平衡的天然抗氧化系统与放疗抵抗密切相关。

2 Nrf2 在肿瘤放疗增敏中的作用

2.1 Nrf2 信号通路概述

Nrf2 属CNC（Cap“n”Collar）家族的核转录因子，在保护细胞免受氧化应激和电离损伤中起重要作用［8］。一个完整的Nrf2 通路由Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）、Nrf2 及ARE 3 个部分构成。

Nrf2 由7 个结构域组成（详见图1），依次命名为Neh1 至Neh7。Nrf2 通过ARE 可调控200 多种基因的表达，其中大部分基因都用于编码解毒、抗氧化等［9］。Keap1 属BTB-Kelch 蛋白家族，包括5 个主要功能域，详见图2。Keap1 是Nrf2 主要的细胞内调节因子，在稳态条件下，Nrf2 与细胞质中的Keap1 偶联以进行泛素化，随后通过蛋白酶体降解，以此维持在较低水平。当受到异生物质或氧化应激物刺激时，这种偶联作用消失，Nrf2 在几种蛋白激酶磷酸化作用下，发生核转移，进入细胞核内，随后与Maf 蛋白结合，再与ARE 结合，激活其下游靶基因中Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达［10-11］。详见图3。

图1 Nrf2 功能结构域示意图

图2 Keap1 功能结构域示意图

图3 Nrf2 信号通路调控机制图

2.2 肿瘤细胞中Nrf2 与放疗增敏的关系

肿瘤细胞中Nrf2 的异常激活导致其下游抗氧化酶表达增加，使其抵抗氧化应激的能力相较于正常细胞大幅增加，ROS 的清除能力增强；同时，Nrf2 还可使DNA的损伤修复能力增强。这2 种都是肿瘤细胞产生放疗抗性的主要机制，故调控肿瘤细胞中异常激活的Nrf2 及其下游基因的表达可达到放疗增敏的效果。

参与肿瘤细胞中Nrf2 活化的途径至少有4 种：1）体细胞内Nrf2，Keap1，Cul3 基因的突变，在肿瘤细胞中引起异常的Nrf2 活化；2）Keap1 基因的表观沉默导致Keap1 的下调和Nrf2 上调；3）与Keap1 相互作用蛋白的积累，如p62/Sqstm1 和p21 可阻断Nrf2 和Keap1 的结合，从而导致Nrf2 积累；4）通过富马酸盐等代谢物对半胱氨酸的修饰，影响Keap1 活性并导致Nrf2 积累［12］。Nrf2 异常激活后，再通过ARE 上调相关抗氧化酶的表达，从而肿瘤细胞内ROS 的清除增加，减轻放疗对肿瘤细胞的杀伤。且抑制肿瘤细胞中过表达的Nrf2 及其所介导的抗氧化防御系统，可达到放疗增敏的效果，使肿瘤细胞经放疗后凋亡增加［13］。

Nrf2 与8-氧鸟嘌呤DNA 糖基化酶（OGG1）基因和53PB1 近端启动子中的ARE 结合，从而增加DNA 修复蛋白的表达，使肿瘤细胞中DNA 的损伤修复增强［14］。在MCF-7和A549 肿瘤细胞中也发现，抑制Nrf2 会导致DNA 的修复能力明显降低，且其修复能力并不依赖于ROS［15］。

表1 可通过调节Nrf2 信号通路实现放疗增敏的中药有效成分

3 中药经Nrf2 调控在肿瘤放疗增敏中的作用

在肿瘤治疗中，中药与化疗、放疗或靶向治疗相结合可提高疗效，减少相关不良反应及并发症的发生，改善患者的生活质量，延长生存时间［16］。可通过调控Nrf2通路实现放疗增敏的几种中药有效成分及其作用机制分别见表1 和图4。

图4 中药有效成分调控Nrf2 实现放疗增敏作用机制简图

鸦胆子苦醇：鸦胆子苦醇是鸦胆子中的苦木内酯类化合物，药理活性广泛，包括抗肿瘤、抗疟疾、抗炎、抗病毒和杀虫活性［23］。SUN 等［17］的研究结果表明，鸦胆子苦醇在增加A549 细胞放疗敏感的试验中，用80 nmol 鸦胆子苦醇处理4 h+6 Gy 照射联合处理组，细胞中ROS水平比对照组增加1.8 倍，DNA 损伤加重，Nrf2 的蛋白表达水平比照射组显著降低（P＜0.05），细胞增殖速率明显减缓（P＜0.01）。可见，鸦胆子苦醇可使暴露于辐射后A549 细胞中Nrf2 的积累减少，从而使细胞中ROS 水平升高，DNA 损伤增强，达到放疗增敏的效果。

异甘草素（ISL）：是甘草的提取物，其在体内外均可显著上调Nrf2 及其下游基因的表达，且随着ISL 使用剂量的增多，Nrf2 蛋白表达增多［24-25］，表明ISL 对Nrf2具有诱导作用。但SUN 等［18］发现，ISL 可通过干扰氧化还原状态，从而提高HepG2 细胞的放射敏感性；其中涉及Nrf2 的下调，使HepG2 细胞内ROS 增加，引起其氧化应激对细胞的损伤增加，从而导致放射增敏。LIU等［9］发现，经过10 μg/mL ISL 处理6 h 后的HepG2 细胞选择性地增强了Keap1 的转录和表达，使Keap1 有效诱导Nrf2 的泛素化降解，抑制Nrf2 向细胞核的转移，导致Nrf2 下游基因表达降低，Nrf2 依赖性抗氧化系统被抑制，细胞内ROS 增加；且经过10 μg/mL ISL 6 h+4 Gy照射联合处理可显著增加HepG2 细胞凋亡及其克隆形成率（P＜0.05）。可见，ISL 通过增加Keap1 表达抑制Nrf2 抗氧化途径，最终通过对氧化还原状态的干扰诱导氧化应激，从而使HepG2 细胞在体内外的放射敏感性均增强，表明ISL 具有放疗增敏效果。

高山金莲花素（AIF）：也称为猫尾草异黄酮，是一种从毛果鱼藤中提取的黄酮类化合物，具有多种药理作用，包括抗动脉粥样硬化、抗菌等［26］。猫尾草主要分布于我国的广西、贵州、云南。ZHANG 等［20］研究了AIF 在食管鳞状细胞癌放疗中的作用，发现5 μm AIF 24 h+6 Gy照射联合处理后可显著抑制食管鳞状癌细胞中Nrf2 及其下游基因HO-1 和NQO-1 的表达，诱导细胞内ROS增多，使DNA 损伤加重，细胞凋亡增加（P＜0.01）；在敲除Nrf2 基因后发现，用AIF+照射处理后并未显著增加癌细胞中的ROS，与Nrf2 未敲除细胞中ROS 的水平相似，且敲除Nrf2 后的AIF 失去了放疗增敏作用。动物实验结果显示，AIF 20 mg/kg+2 Gy 照射联合处理后，体内形成的肿瘤质量显著小于对照组（P＜0.01）。可见，AIF 通过抑制Nrf2 及其下游基因NQO-1 和HO-1的表达，从而增加辐射诱导的ESCC 细胞中ROS 的产生，达到放疗增敏的效果。

染料木黄酮：是一种具有多种生物活性的天然异黄酮，主要存在于豆科植物中，药理作用主要有抗炎、抗血管生成和抗癌活性［27］。LIU 等［21］研究发现，染料木黄酮可选择性地对非小细胞肺癌（NSCLC）A549 细胞显示放射增敏作用，但其对正常肺成纤维细胞MRC-5 无作用。研究发现，10μm 染料木黄酮经48h+ 4 Gy 照射后降低了A549 细胞Keap1 启动子区域的甲基化水平，导致其mRNA 表达增加，有效抑制Nrf2 向细胞核的转移，进而抑制Nrf2 依赖性抗氧化酶的表达，使得细胞内ROS 上调，对细胞的损伤加重，细胞中NQO1 蛋白的表达被显著抑制（P＜0.01）。两者联合处理后，A549 细胞存活分数、生长速度均明显低于对照组（P＜0.01）。可见，染料黄木酮可通过抑制Keap1 启动子区域的甲基化，进一步抑制Nrf2 及其下游基因的表达，从而导致其对NSCLC 的A549 细胞实现放疗增敏作用。

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）：是绿茶中的主要多酚物质，属黄烷醇类，具有强抗氧化性和抗癌性，在癌症的预防、发生和发展过程都有治疗作用［28］。ENKHBAT 等［22］报道指出，EGCG 通过Nrf2 信号通路使结直肠癌细胞达到放疗增敏的效果。12.5μmol EGCG经24 h+2 Gy 照射联合治疗后，结肠癌细胞HCT116 的克隆形成率显著降低（P＜0.05），联合处理后细胞自噬及凋亡相关的mRNA 和蛋白（LC-3 及caspase-9 mRNA）表达水平增加，由于Nrf2-Keap1-P62 通路所促进的细胞自噬是维持细胞稳定状态的一个基本降解机制。细胞自噬中的线粒体自噬在肿瘤微环境中，通过清除肿瘤细胞中功能失调的线粒体可发挥抗肿瘤作用。可见，EGCG 和放射联合治疗可诱发肿瘤细胞中的线粒体自噬，从而导致肿瘤细胞的凋亡。

其他潜在增敏药物：克罗苷元是从牛角瓜中提取出来的，可抑制Nrf2 及其驱动的抗氧化剂分子NQO-1的表达，使A549 细胞实现放疗增敏［29］。栗子叶提取物或可通过抑制Nrf2 增加乳腺癌CSCs 对抗癌药紫杉醇的敏感性，实验发现其可显著降低MCF-7 来源的CSC中Nrf2 的核转移和抗氧化酶蛋白的表达［30］。常春藤皂苷元是从常春藤叶中提取的三萜类化合物，可抑制Nrf2-ARE 途径，并激活头颈癌细胞中的P53，从而增强ROS 产生，并促进谷胱甘肽耗竭，诱导耐药头颈癌细胞的凋亡［31］。铃兰毒苷是类洋地黄化合物，最新研究发现，其对Nrf2/ARE 有抑制作用，且其抑制机理不是通过转录介导的，而是通过蛋白水解调节的［32］。汉黄芩素来自于药用植物黄芩，黄芩广泛用于治疗各种疾病，包括炎症、过敏反应、肿瘤、腹泻等，能减少Nrf2 的核转移，提高细胞内ROS 水平，进而杀死肿瘤细胞［33］，其主要通过减少Nrf2 mRNA 转录下调Nrf2 表达［34］。

4 小结

中药是肿瘤辅助治疗的重要组成部分，已进行的基础和临床研究表明，中药在抑制肿瘤进展，提高放疗、化疗、靶向治疗的敏感性方面具有优势。Nrf2 在肿瘤的预防及进展中的双重作用决定了其特殊性，中药成分可通过诱导Nrf2 及其靶向基因的表达在协调机体抵抗氧化应激所带来的损伤，但在肿瘤细胞中由于Nrf2 的过表达，抵抗氧化应激的增强导致放疗抵抗。中药成分亦可通过调控Nrf2 实现放疗增敏，且同一中药有效成分对Nrf2 通路的调控在不同实验中也存在差异。异甘草素、高山金莲花素、染料木黄酮通过抑制Nrf2 表达可实现放疗增敏作用，但也可作为Nrf2 激活剂，有助于细胞抵抗氧化应激。因此，目前仍需进一步研究同一中药成分在不同细胞中对Nrf2 的调控存在差异的原因，以及由于Nrf2 双重作用的存在，中药成分通过Nrf2 达到放疗增敏时对机体整体的综合作用。