萝卜硫素对宫颈癌HeLa 细胞凋亡及放射敏感性的影响

张亚芳，赵晓红，王德珠，张华凤，王小花

（海南省妇女儿童医学中心妇产科，海南 海口 570206）

放射治疗（简称放疗）是治疗中晚期宫颈癌的主要手段，可实现宫颈癌的局部控制。但在宫颈癌的治疗中，耐放射治疗越来越受到重视，因其是放疗临床失败的原因之一［1］。但这种肿瘤耐辐射的分子机制尚不完全清楚。肿瘤细胞在细胞周期的G2/M 期对放射最敏感，在S 期对放射最耐受［2］。放疗可激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT），这些通路调节细胞的增殖和凋亡，抑制这些途径可增强细胞的放射敏感性［3］。流行病学研究表明，经常食用水果和蔬菜对癌症的发展具有抑制作用［4］。萝卜硫素广泛存在于西兰花、卷心菜、花椰菜、甘蓝、萝卜、芥菜等十字花科植物中，在体外可抑制包括人结肠癌、白血病和前列腺癌细胞在内的几种癌细胞系的增殖，并增加其凋亡［5］。萝卜硫素还可诱导G2/M 期细胞周期停滞，降低S 期细胞的百分比，抑制体外癌细胞的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性，并在体内延迟前列腺癌（PC-3）异种移植瘤的生长［6］。此外，萝卜硫素和其他药物联用可进一步抑制细胞生长，从而使药物和放疗剂量降低到比单用时更安全的水平，以确保更低的癌症发生率和不良反应等级［7］。本研究中观察了萝卜硫素对HeLa 细胞凋亡及体外放射的增敏作用，为宫颈癌的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：MK3 型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；Clinae 23EX 型直线加速器（美国Varian 公司）；Ti-s 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；BD 垂直电泳仪，BD/FACSC anto Ⅱ流式细胞仪，均购自美国BD 公司；E-Gel Imager 型凝胶成像仪（美国UVP 公司）。

试药：萝卜硫素（纯度大于99%，上海研生生化试剂有限公司）；RPMI-1640 培养基和胎牛血清（美国HyClone 公司）；胰酶和青链霉素溶液（美国Corning 公司）；四氮唑（MTT，美国Amresco 公司）；细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒（美国BD 公司）；细胞蛋白抽提试剂盒（碧云天生物技术研究所）；细胞外信号调节激酶（ERK1/2），磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2），Akt、磷酸化Akt（p-Akt），半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3），β-actin 抗体，均购自美国Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶HRP 标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG 二抗（武汉艾美捷科技有限公司）。

细胞：宫颈癌HeLa 细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。

1.2 细胞培养

用含胎牛血清（10%）的RPMI-1640 培养液在37℃、5%CO2条件下培养HeLa 细胞，隔日换液，选择对数生长期细胞进行试验。

1.3 MTT 法检测萝卜硫素和放射线的生长抑制作用

将HeLa 细胞以5×103个/孔接种于96 孔板中（每孔200 μL），用不同浓度萝卜硫素（0，10，20，40，80，160，320 μmol/L）或不同剂量放射线（0，1，2，4，6，8 Gy）干预24 h 后加入MTT（每孔50 μL），继续培养4 h，离心，弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO），每孔200 μL，振荡，用酶标仪在450 nm 波长处检定吸光度值（OD值），计算细胞抑制率。细胞抑制率=OD对照组-OD处理组/OD对照组×100%。

1.4 克隆形成试验观察萝卜硫素的放射增敏作用

将HeLa 细胞分为放射组和联合组。取对数生长期的HeLa 细胞以103个/孔接种于6 孔板中（每孔3 mL），待细胞贴壁后，联合组加入含有半数抑制浓度（IC50）的萝卜硫素，放射组不加萝卜硫素，同时用不同剂量放射线（0，1，2，4，6，8 Gy）照射24 h 后更换培养液，正常培养14 d，隔天换液。将细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，用甲醇固定，并用Giemsa 溶液染色。由2 名研究人员独立在显微镜下手动计数至少包含50 个细胞的菌落数。计算细胞克隆形成率（PE）和存活分数（SF），PE=菌落形成数/接种数×100% ，SF=PE测试组/ PE对照组×100% 。应用GraphPad Prism 软件5.01，按照SF=1-（1-eD/D0）N 公式生成剂量-生存曲线，并计算放射生物学参数，包括平均致死剂量（D0）、准致死剂量阈值剂量（Dq），临床实践中每日剂量2 Gy（SF2），外推数（N），D0时放射增敏比（SERD0）=D0对照组/D0实验组；Dq时放射增敏比（SERDq） =Dq对照组/D0实验组［8］。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期

将HeLa 细胞分为对照组、联合组、萝卜硫素组和放射组。对照组不进行处理，联合组用含有IC50的萝卜硫素和半数抑制剂量的放射线进行处理，萝卜硫素组用含有IC50的萝卜硫素处理，放射组用半数抑制剂量的放射线进行处理。将HeLa 细胞以5×104个/孔接种于6 孔板内（每孔3 mL），待细胞贴壁后，按上述分组分别处理HeLa 细胞24 h，弃培养基，消化后转移至离心管内，离心，弃上清液，根据试剂盒说明书，用流失细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。

1.6 蛋白质印迹（WB）法检测蛋白表达

以5×104/孔接种于6 孔板内（每孔3 mL），待细胞融合加入，按1.5 项下方法分组，分别处理HeLa 细胞24 h，收获细胞，根据细胞量加入细胞蛋白抽提液，进行电泳，每孔上样量为20 μg，将印迹转移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脱脂牛奶在室温下封膜1 h，将膜与相应抗体进行孵育，4 ℃过夜，用TBST 缓冲液对膜进行2次冲洗，将二抗（1 ∶5 000）在室温下孵育30 min。用ECL法显色，采集图像进行分析。

1.7 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计学软件分析。试验结果采用均数±标准差（）表示，分析前进行正态检验，用单因素方差分析进行判断，组间两两比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 萝卜硫素对HeLa 细胞抑制作用的影响

随着萝卜硫素浓度的增加，HeLa 细胞抑制率增加，与0 μmol/L 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。萝卜硫素对HeLa 细胞的IC50为（76.28±9.27）μmol/L，故选80 μmol/L 作为干预浓度。详见图1。

2.2 放射线对HeLa 细胞抑制作用的影响

随着放射线剂量的增加，HeLa 细胞抑制率增加，与0 Gy 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。放射线对HeLa 细胞的半数抑菌剂量为（2.13±0.27）Gy，故选2 Gy作为半干预剂量（P＜0.05）。详见图2。

图1 萝卜硫素对HeLa 细胞抑制作用的影响

图2 放射线对HeLa 细胞抑制作用的影响

2.3 萝卜硫素对HeLa 细胞放射敏感性的影响

随着放射剂量的增加，放射组和联合组细胞存活率均降低，且联合组各放射剂量的细胞存活率均低于放射组，差异有统计学意义（P＜0.05）。萝卜硫素能提高HeLa 细胞的放射敏感性，SERD0和SERDq分别为1.517 和2.024。详见表1 和图3。

表1 剂量-生存曲线的放射生物学参数

2.4 萝卜硫素对HeLa 细胞凋亡和细胞周期的影响

各组HeLa 细胞G0/G1期细胞比例变化不显著，差异无统计学意义（P ＞0.05）；与对照组比较，其余各组HeLa 细胞凋亡和G2/M 期细胞比例增加，S 期细胞比例降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与萝卜硫素组和放射组比较，联合组HeLa 细胞凋亡和G2/M 期细胞比例增加，S 期细胞比例降低，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2 和图4、图5。

图3 萝卜硫素对HeLa 细胞放射敏感性的影响

表2 萝卜硫素对HeLa 细胞凋亡和细胞周期的影响（±s，%）

表2 萝卜硫素对HeLa 细胞凋亡和细胞周期的影响（±s，%）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与萝卜硫素组比较，b P＜0.05；与放射组比较，c P＜0.05。

组别对照组萝卜硫素组放射组联合组细胞凋亡率1.95±0.13 3.12±0.18a 4.35±0.46ab 6.35±0.37abc G0/G1 62.51±4.28 60.07±4.58 60.38±7.59 62.48±6.73 S 25.95±2.06 22.29±3.17a 20.14±5.36ab 14.50±4.83abc G2/M 11.54±2.17 18.64±0.25a 19.48±3.54ab 23.02±4.92abc

2.5 萝卜硫素对HeLa 细胞中ERK1/2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表达的影响

与对照组比较，其余各组HeLa 细胞中ERK1/2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与萝卜硫素组和放射组比较，联合组HeLa 细胞中ERK1/2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

3 讨论

图4 萝卜硫素对HeLa 细胞凋亡的影响

萝卜硫素最早于1992年在花椰菜芽中被发现，是一种著名的抗癌化学预防剂，可抑制骨肉瘤细胞和其他恶性肿瘤的生长，其肿瘤抑制作用已在临床试验中被评估，包括前列腺癌患者的Ⅱ期试验［9］。虽然萝卜硫素的抗癌作用已在众多研究中被报道，但其增强癌细胞放射敏感性的作用至今未被研究。同时，相比于其他化学治疗（简称化疗）药物的高毒性和多种不良反应，大鼠口服有效剂量的萝卜硫素后，其最大血药浓度为20 μmol/L，但人类口服富含萝卜硫素的西兰花芽后，最大血药浓度仅为2 μmol/L［10］。本研究结果显示，萝卜硫素对体外培养的HeLa 细胞增殖有抑制作用，且呈浓度依赖性。在克隆形成试验中，与未加萝卜硫素处理的细胞相比，萝卜硫素处理细胞的放射敏感性呈剂量依赖性增加，表明萝卜硫素可增强HeLa 细胞的放射敏感性。

图5 萝卜硫素对HeLa 细胞周期的影响

表3 萝卜硫素对HeLa 细胞中ERK1 /2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表达的影响（±s）

表3 萝卜硫素对HeLa 细胞中ERK1 /2，p-ERK1/2，Akt，p-Akt，Caspase-3 蛋白表达的影响（±s）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与萝卜硫素组比较，b P＜0.05；与放射组比较，c P＜0.05。

组别对照组萝卜硫素组放射组联合组ERK1/2 0.32±0.04 0.76±0.08a 0.91±0.05ab 1.38±0.27abc p-ERK1/2 0.28±0.04 0.62±0.05a 0.73±0.07ab 1.17±0.20abc Akt 0.75±0.09 0.81±0.10a 1.06±0.37ab 1.54±0.43abc p-Akt 0.22±0.03 0.28±0.02a 0.36±0.03ab 0.58±0.09abc Caspase-3 0.43±0.04 0.52±0.04a 0.68±0.05ab 0.82±0.09abc

细胞周期阻滞和凋亡被认为是萝卜硫素最重要的作用机制［11］。研究表明，在细胞周期中，G2/M 期对放射最敏感［12］。因此，诱导细胞周期阻滞在G2/M 期的药物在体内外都表现出了很强的放射敏感性。萝卜硫素在人骨肉瘤U2OS 细胞中诱导G2/M 阻滞和凋亡［13］，在人骨肉瘤MG63 细胞中诱导生长阻滞，并以p53 独立的方式上调p21WAF1/CIP1 蛋白的表达［14］。本研究中流式细胞术结果显示，萝卜硫素或（和）萝卜硫素联合放射可抑制G2/M 期细胞周期进展，诱导HeLa 细胞凋亡。但萝卜硫素和放射的确切协同作用机制目前尚不清楚。据报道，激活ERK1/2 和Akt 激酶可使G2/M 期停止，增加细胞对放射诱导的细胞死亡敏感。但辐射抵抗可能是由于放射抑制ERK1/2 和Akt，导致肿瘤细胞动态快速适应，以维持生长和生存能力［15-16］。因此，ERK1/2 和Akt的激活可能增强肿瘤的放射敏感性。萝卜硫素通过引起G2/M 期阻滞来抑制LM8 细胞的生长，表现为促进细胞Akt 和ERK1/2 的磷酸化，通过Caspase-3 的裂解和激活，调节细胞凋亡和细胞增殖［17］。在胰腺癌细胞中，萝卜硫素通过抑制PI3K/Akt 和MEK/ERK 通路诱导细胞凋亡［18］。本研究结果显示，萝卜硫素增强了放射诱导的ERK1/2 和Akt 磷酸化，表明萝卜硫素可增强HeLa细胞的放射敏感性。

综上所述，萝卜硫素通过G2/M 期阻滞诱导HeLa细胞凋亡，并通过ERK 和Akt 的激活，增强了HeLa 细胞的放射敏感性。萝卜硫素联合放射可能有助于增强萝卜硫素的抗肿瘤作用，提示萝卜硫素可能是一种有效的放射增敏剂。