微生物法测定腐乳中维生素B12含量的研究

（浙江工业职业技术学院鉴湖学院，浙江绍兴312000）

维生素 B12（vitamin B12，VB12）也称为钴胺素（cobalamin），是唯一一种含有金属元素的B族维生素。维生素B12能够通过作为辅酶来参与蛋白质与核酸的合成，在人体的代谢过程中发挥重要的作用[1]。维生素B12是在维持大脑正常功能中起关键作用的必需营养素，主要用于生成神经脂蛋白并维持神经髓鞘的生理功能，能够提高叶酸的利用率，预防抑郁症、老年痴呆及贫血等[2]。人体缺少维生素B12会造成脊髓变形、精神抑郁、消化道黏膜发炎，增加患心脏病的机率，是一种人体必不可少的水溶性维生素。但是，这种维生素人体不能自主合成，并且植物性食物中VB12的含量极少，人体只能通过动物性食品或药品进行补给[3]。食品中的维生素B12通常是通过微生物代谢的方式进行合成，因此发酵食品中的维生素B12的含量较高，如泡菜、腐乳、酱油、纳豆等。其中，腐乳是典型的大豆发酵制品，含有多种必需氨基酸、有机酸。通过微生物发酵，腐乳会代谢产生一些益生物质，其中维生素B12是一种重要的益生成分[4]，但其在腐乳中的含量研究较少。

目前，测定维生素B12的方法主要有分光光度法、原子吸收法[5]、微生物法及高效液相色谱法[6-7]等。但是发酵食品的基质较为复杂，利用仪器测定维生素B12的含量干扰性较大、准确性较低。而微生物法是国际上测定维生素B12含量公认的方法，主要原理是菌种在生长过程中对维生素具有特异性需求，通过选取特定菌种对其进行培养，并根据繁殖程度进行判断。再通过维生素B12的含量与吸光度绘制标准曲线，计算出维生素B12的含量[8]。沈泓等[9]采用微生物法检测食品中维生素B12的含量，结果表现出较好的线性关系。此种方法能够准确、灵敏的测定维生素B12含量较低、基质较复杂的样品。因此，本试验采用微生物法，通过莱士曼氏乳酸杆菌测定不同种类的腐乳（白腐乳、红腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳）中维生素B12的含量，为腐乳制品中维生素B12的含量提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白腐乳、红腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳：市售；莱士曼氏乳酸杆菌（LactobacillusleichmanniiATCC7830）：上海北诺生物科技有限公司；维生素B12标准品（纯度≥99%）：美国Sigma公司；乳酸杆菌肉汤培养基、乳酸杆菌琼脂培养基：江苏酶联生物科技有限公司；维生素B12测定用培养基：美国BD公司。

1.2 仪器与设备

DNP-9052电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；JD500-2电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；PHS-25型pH计：上海精科雷磁仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

将莱士曼氏乳酸杆菌活化后转种3代，离心弃去上清液，加入10 mL 9%生理盐水，混匀，重复操作3次。在550 nm波长下测试菌液60%～80%的透光率，立即取1 mL测试菌液并稀释10倍（静置时间为0 h），在550 nm处测试菌悬液的吸光度，使其透光率在60%～80%之间。

按上述操作，测试菌悬液静置1、2、3 h后，各吸取1 mL测试菌液并稀释10倍后进行培养，并将9%生理盐水分别换成无菌水、磷酸盐缓冲液、维生素B12测定培养基，计算菌落生长数。

1.3.2 维生素B12标准溶液的制备

称取1 mg VB12标准品，稀释至含VB12质量浓度分别为 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 ng/mL，在使用前120℃灭菌5 min后迅速冷却。取1.0 mL上述标准品溶液于5 mL培养基，再使用灭菌水定容至10 mL，平行3份，绘制标准曲线。

1.3.3 样品处理

采用100 mL蒸馏水将1.3 g无水磷酸氢二钠、1.0 g无水偏重亚硫酸钠、1.2 g柠檬酸溶解，取10 mL加入一定量的腐乳样品（白腐乳、红腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳），加入150 mL蒸馏水并超声振荡处理0.5 h，而后121℃水解10 min冷却后调节pH值至4.5，蒸馏水定容至250 mL后过滤，取滤液5 mL，加入20 mL蒸馏水，调pH值至中性并定容至100 mL。

1.3.4 样品待测液的制备及培养

取 1、2、3、4、5 mL 样品溶液于 5 mL 乳酸杆菌琼脂培养基，再使用灭菌水定容至10 mL。接种菌悬液（静置1 h，维生素B12测定培养基）50 μL（对照组的样品管除外）于上述培养管中并36℃进行培养36 h。

2 结果与分析

2.1 维生素B12标准曲线

以维生素B12的质量浓度为横坐标，在波长550 nm处测定的吸光度为纵坐标绘制VB12标准曲线，结果见图1。

图1 维生素B12标准曲线Fig.1 Standard curve of vitamin B12

由图1可知，维生素B12质量浓度为0.01 ng/mL～0.10 ng/mL时，回归方程为y=4.162 6x+0.080 2，R2=0.994 4，线性关系良好，能够用其计算VB12的含量。

2.2 菌悬液放置时间与培养菌液对菌落总数的影响

表1为在相同的试验步骤和数据参数下，菌悬液放置不同时间和不同种类的培养菌液对菌落总数的影响。

表1 菌悬液放置时间与培养菌液对菌落总数的影响Table 1 The effect of culture medium and time of bacterial suspension on the total number of colonies

菌悬液在放置0 h时，不同种类的培养菌液对菌落总数的影响并不显著，菌落总数的范围在3.1×106CFU～4.9×106CFU。菌悬液放置1 h后，9%生理盐水的处理组菌落总数显示出增加的趋势，然而无菌水和磷酸盐缓冲溶液的处理组菌落总数呈现下降的趋势。但是菌悬液在放置2 h后，9%生理盐水、无菌水和磷酸盐缓冲溶液菌落总数均呈现显著的下降趋势，分别降至3.4×106、0.03×106CFU 和 0.007 4×106CFU。在放置 3 h时菌落总数分别降低至 0.7×106、0.000 3×106CFU 和0.000 8×106CFU。这可能是9%生理盐水、无菌水和磷酸盐缓冲溶液因渗透压的影响，并且缺少莱士曼氏乳酸杆菌所需的营养成分的缘故。当培养菌液为维生素B12测定培养基时，菌悬液放置时间为1 h～3 h，菌落总数均呈现增加的趋势，达到8.2×106CFU～9.0×106CFU。可见4种稀释液中只有维生素B12测定培养基作为稀释液时，菌落总数能够处于增加并趋于稳定。综合考虑试验时间的优化，采用菌悬液放置1 h并选用维生素B12测定培养基作为稀释液进行菌种的培养。

2.3 不同厂家腐乳中维生素B12含量分析

本试验选取了4种不同种类的腐乳制品，其中包括红腐乳、白腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳，每种腐乳选取3个不同厂家的产品应用微生物法测定维生素B12的含量。表2为不同厂家4种类型的腐乳中VB12的含量以及4种类型的腐乳维生素B12的平均含量。

表2 不同种类腐乳中维生素B12的含量Table 2 Vitamin B12content in different kinds of sufu

相关数据表明大豆中几乎不含有维生素B12，但其经过发酵后维生素B12的含量显著增加。在本试验中，红腐乳中维生素 B12的含量 0.54 μg/100 g～0.76 μg/100 g之间，白腐乳中维生素B12的含量0.41 μg/100 g～0.58 μg/100 g，而青腐乳（即臭腐乳）中维生素 B12的含量为 5.12 μg/100 g～7.01 μg/100 g 之间，玫瑰腐乳中维生素 B12的含量为 3.73 μg/100 g～4.08 μg/100 g 之间。可见，大豆经过发酵后都能够合成维生素B12。曲勤凤等[10]研究了腐乳、韩国大酱、豆豉等发酵食品，结果表明腐乳中尤其是臭腐乳的维生素B12的含量远高于其他的发酵食品。同一类型的腐乳中维生素B12含量存在明显的差异性，这可能是每个厂家的生产工艺和控制要求不同，此外在腐乳的发酵过程中选用的菌种对腐乳中维生素B12的含量也有一定的影响。万红芳等[11]通过对比发现霉菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸菌等微生物影响着腐乳的品质和营养成分。曹蕾蕾等[12]利用少孢根霉发酵腐乳，并在发酵前期使用乳酸优化生长环境，使得腐乳中的维生素B12含量的显著增加。

2.4 不同种类腐乳中维生素B12平均含量分析

图2为每种腐乳3个厂家VB12的平均含量。

图2 不同种类腐乳中维生素B12的含量Fig.2 The content of vitamin B12in different kinds of sufu

在本试验中，红腐乳中维生素B12的平均含量为0.63 μg/100 g，白腐乳中维生素 B12的平均含量 0.49 μg/100 g，而青腐乳（即臭腐乳）中维生素B12的平均含量为7.01 μg/100 g，玫瑰腐乳中维生素B12的平均含量为3.87 μg/100 g。4种腐乳中青腐乳的维生素B12的含量最高，可见青腐乳在发酵过程中除了分解蛋白质产生氨基酸外，还合成了更多的维生素B12，其含量可达红腐乳和白腐乳的10倍多（P＜0.05）。这可能因为青腐乳相对于其他类型的腐乳发酵的更为彻底，环境中能够合成维生素B12的菌种更多，从而产生了更多的维生素B12。另外，玫瑰腐乳中维生素B12的含量为红腐乳和白腐乳7倍多（P＜0.05），是因为玫瑰腐乳中玫瑰成分经过发酵后也产生了较多的营养成分，维生素B12的含量高于红腐乳和白腐乳。同样，余明远[13]通过对比玫瑰腐乳与普通腐乳中的营养成分，发现玫瑰腐乳中含有较高的维生素B12，红腐乳、白腐乳中维生素B12的含量相对较少，人体内缺乏维生素B12时很难通过食用红腐乳、白腐乳进行补充，且植物性食物中几乎不含有维生素B12，素食主义者可以通过适当的食用青腐乳和玫瑰腐乳来补充人体所需的维生素B12。

3 结论

本试验表明将菌悬液放置1 h并选用维生素B12测定培养基作为稀释液利于菌种的培养，以红腐乳、白腐乳、青腐乳和玫瑰腐乳这4种腐乳为研究对象，采用微生物法对其维生素B12的含量进行测定。结果表明，不同厂家生产的腐乳维生素B12含量存在显著差异。4种腐乳中，红腐乳和白腐乳中维生素B12的含量较低。青腐乳因比其他类型的腐乳发酵更为彻底而具有最高的维生素B12，是红腐乳和白腐乳的10倍多。玫瑰腐乳中的玫瑰成分经过发酵后会产生较多的营养成分，维生素B12的含量也较高。本文旨在为腐乳等相关发酵食品中维生素B12的研究提供试验方法和数据参考。