产细菌素乳酸菌的筛选、鉴定及抑菌特性研究

迟 海 李学英 徐春霞 杨宪时 鲁淑彦，3

（1 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海200090 2 福建省闽东水产研究所 福建宁德352100 3 上海海洋大学食品学院 上海201306）

食品致病菌污染和繁殖一直是威胁食品安全的首要问题之一[1-2]。相关统计数据显示，我国食源性疾病案例呈逐年上升的趋势[3]。传统食品企业解决食品致病菌残留及污染的一般方式是改变加工工艺、高强度杀菌或添加化学抑菌物质。然而，改变加工工艺或高强度杀菌不仅会破坏食品原有风味，还可能使食品品质下降，影响其营养价值。此外，化学抑菌剂残留可能对人体造成潜在危害。而目前消费者对绿色安全和高效的抑菌物质的需求越来越迫切。

细菌素是一种细菌在代谢过程中通过核糖体合成而产生的一类抑菌肽[4]。由于乳酸菌普遍被人们定义为安全的微生物，因此，乳酸菌细菌素被认作传统化学抑菌物质和抑制食品致病菌的绿色、高效代替品之一，并逐渐引起人们关注。目前，乳酸链球菌素（nisin）作为唯一通过FDA/WHO 认证的细菌素，主要应用于食品制品中[5]。然而，微生物耐药性的进化使得耐nisin 的食品致病菌被检出[6]。筛选具有广谱抑菌性的乳酸菌并对其抑菌特性进行测定，对乳酸菌细菌素的发展和应用有一定的意义。

本研究从市售豆腐乳中提取乳酸菌，以提取的乳酸菌为指标菌，抑制3 种常见的食品致病菌（金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和蜡样芽胞杆菌），筛选具有广谱抑菌效果的乳酸菌。同时，通过对产细菌素的乳酸菌分子、生理生化及抑菌机理进行研究，旨在鉴定新型绿色安全的产细菌素乳酸菌的作用效果，探索其抑菌机理，为抑制食品常见致病菌及乳酸菌的细菌素的发展、应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售豆腐乳，上海某超市。生理盐水、甘油、营养琼脂、乳酸菌培养基、M17 培养基、脑心浸液培养基、多粘菌素B、葡萄糖基均，国药；API 50CH细菌糖代谢试剂盒，法国梅里埃公司；DNA 提取试剂盒，美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

Nano drop2000c 分光光度计、PCR 仪，美国thermo 公司；水平电泳槽及成像系统，美国biorad 公司；MP Fastprep-24 样品处理仪，美国MP公司；酶标仪Power Wave XS，美国伯腾仪器有限公司；YP200N 型天平，上海菁海仪器有限公司；HH.B11.500-BS-Ⅱ恒温培养箱，上海跃进医疗机械厂；超净工作台SEX-TJ，上海整新电子设备。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌的筛选 无菌条件下将10 g 豆腐乳研磨并溶解于90 mL 生理盐水中，均质2 min 后涂于预先添加多粘菌素B（0.5 g/L）的乳酸培养基中。无氧条件下于30 ℃培养48 h。培养结束后，将生长于乳酸培养基的单菌落重新划线，乳酸菌肉汤中30 ℃条件下培养过夜。通过革兰氏染色[7]，过氧化氢酶反应[8]和pH 值测定对乳酸菌进行筛选。将筛选好的乳酸菌划线保存。

1.3.2 抑菌活性的测定 以3 株常见的食源性致病菌（金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和蜡样芽胞杆菌）为指示菌，以分离的乳酸菌为指标菌，使用琼脂扩散法将100 μL 过夜的指示菌加入5 mL 脑心浸液培养基（含0.8%的营养琼脂）中，摇匀后倾倒入脑心浸液培养基（含2.5%的营养琼脂）。将3 μL 指标菌点入脑心浸液培养基上，于有氧条件下30 ℃培养过夜。培养结束后，培养基中呈明亮的抑菌圈被认为指标菌具有抑菌活性，否则被认为不具有抑菌活性。保存具有抑制上述所有指示菌的潜在乳酸菌（指标菌A），划线保存以备后续试验。

1.3.3 抑菌稳定性的测定 将指标菌A 在30 ℃培养10 h 后分别在不同条件（121 ℃10 min，100℃30 min 和90 ℃50 min）下进行热处理。同1.3.2 节的方法，将3 μL 热处理的指标菌点入具有指示菌的培养基，并在指标菌旁滴加1 μL 不同的酶试剂（20 μg/mL 的蛋白酶K 和1 mg/mL 的胰蛋白酶）。以滴加3 μL 未经过上述处理的指标菌为空白对照。培养基中呈明亮的抑菌圈被认为指标菌具有抑菌活性，否则被认为不具有抑菌活性。

1.3.4 16 S rDNA 提取、PCR 扩增及菌种鉴定 指标菌A 的基因组学DNA 使用Fastprep 将样品打碎，并结合DNA 试剂盒提供的使用方法提取。PCR 扩增以指标菌A 的基因组学DNA 为模版，使用OneTaq 酶试剂与上游引物5’-TAACACAT GCAAGTCGAACG-3’，下游引物5’-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3’建立25 μL 扩增体系。扩增条件为：94 ℃预变性3 min；进入PCR 循环阶段后，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸20 s，共30 个循环；68 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL PCR 扩增产物在1%琼脂糖凝胶下电泳，一定时间后观测并记录PCR 扩增产物。PCR 扩增产物使用试剂盒回收，20 μL 体系送样检测鉴定。

1.3.5 乳酸菌糖代谢能力测定 指标菌A 对糖代谢能力使用API 50CH 试剂盒测定。试剂盒在30℃条件下培养24 h 后记录颜色变化，48 h 后对颜色变化进行比对和确定。

1.3.6 细菌素抑菌范围测定 以15 株不同菌属为指示菌（其中包括3 株不同的产细菌素的乳酸菌），采用1.3.2 节的方法。测定不同指示菌A 的抑菌范围及能力。

1.3.7 基因组重复序列PCR 基因组重复序列PCR 采用Versalovic 等[9]方法。PCR 扩增以指标菌A 的基因组学DNA 为模版，以5’-IIIICGICGI CATCIGGC-3’ 和5’-ICGICTTATCIGGCCTAC-3'分别为上下游引物，使用fusion 酶试剂，建立25 μL 扩增体系。扩增条件为：95 ℃预变性7 min；进入PCR 循环阶段后，94 ℃变性1 min，41 ℃退火1 min，65 ℃延伸3 min，共35 个循环；65 ℃延伸16 min，4 ℃保存。取5 μL PCR 扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶下电泳，一定时间后观测并记录PCR 扩增产物。

1.3.8 乳酸菌细菌素抑菌机理 指示菌A 接种在5 mL 的乳酸菌肉汤中，30 ℃条件下培养过夜。培养结束后，在9 000 r/min 条件下离心30 min。取上清液并在沸水中保温15 min，冰上冷却10 min 后将100 μL 上清液添加到在96 孔板中，以乳酸菌肉汤进行梯度稀释。然后将100 μL 稀释至50 倍体积的金黄葡萄球菌添加至96 孔板内。30 ℃条件下，每隔一定时间内测定OD600nm。

2 结果与分析

2.1 产细菌素乳酸菌的筛选

通过革兰氏染色（阳性）、过氧化氢酶反应（阴性）及乳酸菌肉汤pH 值（≤4.0）的测定，从市售豆腐乳中筛选出64 株乳酸菌。将全部乳酸菌作为指标菌，筛选可以抑制常见的食源性致病菌的乳酸菌。结果筛选出4 株潜在产细菌素乳酸菌（命名为DH2001，DH2002，DH2003 和DH2004） 可以抑制所有的食源性致病菌。

细菌素的筛选一般通过抑制一株或特定指示菌，然而少量指示菌的选择往往会对已知细菌素重复筛选。本试验以3 株常见食品致病菌为特定指示菌，同时对产细菌素乳酸菌的抑菌范围能力进行测定，降低了对已知细菌素重复筛选的可能，而且达到筛选出具有广谱抑菌能力的新型产细菌素乳酸菌的要求。

2.2 乳酸菌细菌素稳定性的测定

乳酸菌所产生的细菌素一般定义为抑制特定细菌的短肽，具有热稳定强，易被蛋白酶分解，pH稳定范围广[4]。表1是在不同条件下4 株乳酸菌细菌素的稳定性结果。结果表明，4 株乳酸菌细菌素在热处理后仍具有良好活性。同时，在酸性和中性条件下活性较碱性条件的活性高。最后，受蛋白酶处理后的乳酸菌细菌素全部失活。

微生物可以产多种抑菌物质 （如过氧化氢、酸、抗生素和细菌素等）[10]。不同于过氧化氢和酸，乳酸菌细菌素热稳定性强，并易被蛋白酶分解；不同于传统抗生素，乳酸菌细菌素一般具有抑菌用量低（毫微摩），专一性强，绿色高效等特点[11]。由于耐抗生素微生物不断检出，细菌素被认为是取代抗生素的方法之一。重要的是，乳酸菌也普遍被认为是安全的微生物。因此，乳酸菌细菌素具有广泛的应用前景。本试验中，4 株乳酸菌细菌素经高温和强酸性处理后仍保持活性。这使得其在食品和药品中具有巨大的应用潜力。

表1 不同条件下乳酸菌细菌素稳定性表现Table 1 Behaviors and stabilities of bacteriocin producers of lactic acid bacteria under different conditions

2.3 产细菌素乳酸菌的鉴定

以上述4 株潜在产细菌素乳酸菌的基因组学DNA 为模版，进行PCR 扩增。PCR 扩增结果（图1） 显示在1.5 kb 处得到清晰的扩增产物条带。PCR 扩增产物在回收处理后送样对细菌进行鉴定。鉴定结果通过NCBI 数据库进行比对，结果显示DH2001 为粪肠球菌 （Enterococcus faecalis），DH2002 为乳酸乳球菌（L.lactis），DH2003 为肠系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），DH2004为乳酸乳球菌（L.lactis）。上述乳酸菌鉴定结果与数据库比对相识度均达到99.9%。目前，由乳酸乳球菌、肠系膜明串珠菌和粪肠球菌产的细菌素研究较为广泛，大量的细菌素也得到提取[12-16]。然而，试验中是否获得已知的细菌素仍需进一步研究。

图1 4 株乳酸菌细菌素的PCR 扩增产物电泳图谱Fig.1 PCR products of four bacteriocin producers from lactic acid bacteria via agarose gel electrophoresis

通过对4 株乳酸菌糖代谢能力的测定结果显示（表2），DH2001 和DH2003 对一些糖代谢能力较差，对密二糖、棉子糖和阿拉伯糖等不能代谢。DH2002 和DH2004 却可以对这些糖进行代谢，而且二者对糖的代谢能力一致。

表2 4 株产细菌素的乳酸菌糖代谢比较Table 2 Comparisons on fermentation profile of four bacteriocins producers

2.4 4 株产细菌素乳酸菌抑菌能力测定

4 株产细菌素乳酸菌的抑菌能力及范围见表3。结果显示，4 株产细菌素乳酸菌的抑菌范围较广。抑菌范围主要为革兰氏阳性菌，包括与其亲缘性较近的种属（如戊糖片球菌）和常见的食品致病菌（如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽胞杆菌和梭状芽胞杆菌属等）。而4 株乳酸菌对革兰氏阴性菌无抑制作用。

研究选取产不同细菌素（Lcn G，nisin 和Lcn A/B/M）的3 株乳酸乳球菌（LFM2001、LFM2081 和LFM2032）作为指示菌。其主要目的是根据产细菌素的乳酸菌有免疫系统[17]，乳酸菌不能被自己产生的细菌素所抑制或消除。选取产细菌素的乳酸菌作为指示菌使得筛选过程中降低了筛选已知细菌素的几率。DH2001 和DH2003 可以抑制所有已知产细菌素的乳酸菌，而DH2002 和DH2004 对产nisin 的乳酸菌无抑制作用，这说明DH2002 和DH2004 可能是产nisin 的乳酸乳球菌。加之二者抑菌范围和糖代谢能力一致，16S rDNA 序列与产nisin A 的乳酸乳球菌基因组序列相似 （99.9%）。因此，认为二者可能为同一株产nisin 的乳酸乳球菌，故只选用DH2002 进行后续试验。

表3 4 株乳酸菌细菌素的抑菌能力比较Table 3 Comparisons on inhibition spectrum of four bacteriocins producers

2.5 基因组重复序列PCR

细菌基因组重复序列PCR 指纹技术具有高度的稳定性，通过对PCR 扩增产物结果分析，可以比较细菌菌株的亲缘关系、多样性和差异性[18]。图2为3 株产细菌素的乳酸菌基因组重复序列PCR 扩增产物电泳图谱。结果表示，3 株产细菌素乳酸菌的PCR 扩增产物差异性较大，说明3 株乳酸菌的基因同源性较低。

2.6 细菌素抑菌机理

图3是3 株乳酸菌细菌素初提物对金黄色葡萄球菌抑制作用机理。结果显示，在12 h 里DH2001 和DH2002 可以完全抑制金黄色葡萄球菌。DH2003 在7 h 内可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，而7 h 后指示菌开始生长。通常情况下，不同细菌素根据抑菌机理不同，其主要抑菌方式有阻止细菌生长（Bacteriostatic）和杀灭细菌（Bactericide）两种。根据试验结果，DH2003 细菌素初提物只对金黄色葡萄球菌有暂时的抑制作用，而DH2001 和DH2002 对金黄色葡萄球菌完全抑制。乳酸菌细菌素的作用机理研究争论较大，相关理论认为乳酸菌细菌素可以随机裂解细胞膜或在细胞膜上形成细孔，阻止/杀灭细菌生长[19]。而其它理论认为乳酸菌细菌素是通过锚定细菌细胞膜上的特定蛋白作为受体，并作用于细胞膜从而形成核结构，造成细菌死亡[10]。Nisin 抑菌机理的研究为后者的理论提供了科学依据。相关试验显示，nisin 通过N 末端锚定细胞膜上的lipid II，从而在细胞膜上形成核结构，最后达到杀灭细菌的目的[20-21]。

目前，对于乳酸菌细菌素抑菌机理的作用只局限于5 种细菌素的研究[21-25]，限制了乳酸菌细菌素应用于食品和药品产业的发展。本研究下一步旨在分析现有乳酸菌细菌素的特点并对其进行提取，最后研究其抑菌机理，为乳酸菌细菌素产业化发展提供基础数据。

3 结论

图2 3 株产细菌素的乳酸菌PCR 扩增产物电泳图谱Fig.2 Repetitive-PCR products of three bacteriocin producers from lactic acid bacteria via agarose gel electrophoresis

图3 3 株乳酸菌细菌素初提物对金黄色葡萄球菌抑制作用机理Fig.3 Model of action of three partial purified bacteriocins produced by lactic acid bacteria against S.aureus

本试验通过从市售豆腐乳中筛选产细菌素的乳酸菌，并将其作用于食品中常见的致病菌，从而鉴定和分析产细菌素乳酸菌的抑菌特性及作用机理。本研究从市售豆腐乳中获取64 株乳酸菌，其中4 株乳酸菌可以同时抑制3 株食品常见致病菌（金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和蜡样芽胞杆菌）。通过对这4 株产细菌素乳酸菌的分子、生化和抑菌能力的测定，这4 株产细菌素乳酸菌分别鉴定为粪肠球菌（DH2001）、乳酸乳球菌（DH2002和2004）和肠系膜明串珠菌（DH2003）。4 株产细菌素乳酸菌对革兰氏阳性菌具有广谱的抑制作用，主要可以抑制厚壁菌门的相关种属（如乳酸乳球菌、戊糖片球菌等），同时这4 株产细菌素乳酸菌对其它食品常见致病菌（如梭状芽孢杆菌）也有一定抑制作用。然而，这4 株产细菌素乳酸菌对革兰氏阴性菌无抑制作用。其中，DH2001 和DH2002 对金黄色葡萄球菌有完全抑制作用，DH2003 对金黄色葡萄球菌有阻止生长的作用。