肌原纤维蛋白磷酸化工艺及多酚协同磷酸化对蛋白凝胶特性的影响

张 典 陈金玉 张坤生 任云霞 尚 坤 吴 鹏

（天津商业大学生物技术与食品科学学院 天津市食品生物技术重点实验室 天津300134）

肌原纤维蛋白（MP）是鸡胸肉中含量最高的蛋白，对鸡胸肉制品的凝胶性能起着决定性作用。在所有动物蛋白中，MP 热诱导凝胶能力最强，0.5%含量就足以产生凝胶，MP 热诱导凝胶是肉制品加工中最重要的特性[1]。近年来，国内外学者研究了各种改性手段（如化学改性[2]和物理改性[3]等）对蛋白的改善效果，而磷酸化改性是目前研究的重要方向[4]。

氧化是肉制品在加工贮藏过程中品质下降的重要原因。作为天然高效抗氧化剂，植物多酚被广泛应用于肉制品中以替代合成抗氧化剂[5-6]。植物多酚来源广泛，具有抗氧化、抗菌、抗炎症、抗过敏以及抗动脉硬化等生理功效，近年来成为人们关注和研究的热点[7-8]。目前，关于磷酸化协同天然多酚对蛋白或肉制品凝胶特性的影响尚缺乏研究。

本文首先通过响应面法对鸡胸肉MP 磷酸化工艺进行优化，在此基础上，研究两种结构不同的天然多酚（绿原酸和没食子酸）协同磷酸化对蛋白凝胶特性（硬度、弹性、白度和保水性）的影响，旨在为多酚与磷酸盐复配在鸡胸肉质构特性的改善方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡胸肉，天津市红桥区华润万家超市西青道店；牛血清蛋白（BSA），美国Sigma 试剂公司；绿原酸，上海源叶生物科技有限公司；没食子酸，上海麦克林生化科技有限公司；其它试剂均为分析纯级。

A2004A 电子天平，上海精天仪器有限公司；PT 2100 高速组织匀浆机，宝创科技股份有限公司；Avanti J-E 高效离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；U-5100 比例光束分光光度计，日立高新技术公司；EL20 实验室pH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司；磁力搅拌器，天津市欧诺仪器仪表有限公司；通风橱，科艺实验室设备研制厂。

1.2 试验方法

1.2.1 预处理及MP 提取 参照Paek 等[9]和Zhang等[10]的方法并改进，鸡胸肉剔除可见的脂肪结缔组织，用刀斩碎成肉糜，加入4 倍体积的蛋白提取 液（0.1 mol/L NaCl，0.002 mol/L MgCl2，0.001 mol/L EDTA·2Na 和0.1 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH=7.0），均质25 s，高速冷冻离心（5 000 r/min，15 min，4 ℃），弃上清液留沉淀，再加入蛋白提取液重复上述操作2 次得粗蛋白。将所得粗蛋白与4 倍体积的0.1 mol/L NaCl 溶液混合，用均质机高速匀浆20 s，高速冷冻离心 （5 000 r/min，15 min，4℃），弃上清液留沉淀，再加入上述NaCl 溶液重复上述操作2 次，最后所得膏状沉淀即为鸡胸肉MP，提取的MP 保存于4 ℃，并于24 h 内用完。

1.2.2 MP 浓度的测定 采用双缩脲法[11]测定蛋白浓度，以牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白。

1.2.3 磷酸化MP 的制备 参考彭倩[12]磷酸化方法并加以改进，按照单因素试验设计用量，将三聚磷酸钠（STP）溶于一定浓度的NaCl 溶液中，并调节pH 至所需。称取一定量的MP 与磷酸化试剂混合，均质后在磁力搅拌器作用下反应一定时间。反应结束后于4 ℃，pH 7.4 的PBS 中透析12 h。

1.2.4 磷酸化程度的测定 采用钼蓝比色法[13]测定磷酸化程度，以磷酸二氢钾作为标准液。

1.2.5 单因素试验 MP 磷酸化过程中，影响磷酸化程度的主要因素为pH 值、蛋白质质量浓度、NaCl 浓度、反应时间和STP 含量。

1.2.5.1 pH 值的确定 称取一定量MP，设置STP含量为2%，NaCl 浓度为0.5 mol/L，蛋白质质量浓度为20 mg/mL，反应时间为2 h，考察pH 为7.0，7.5，8.0，8.5 和9.0 条件下MP 磷酸化程度。

1.2.5.2 蛋白质质量浓度的确定 称取一定量MP，pH 值由1.2.5.1 节确定，设置STP 含量为2%，NaCl 浓度为0.5 mol/L，反应时间为2 h，考察蛋白质质量浓度为10，15，20，25，30 mg/mL 条件下MP 磷酸化程度。

1.2.5.3 NaCl 浓度的确定 称取一定量MP，pH由1.2.5.1 节确定，蛋白质质量浓度由1.2.5.2 节确定，设置STP 含量为2%，反应时间为2 h，考察NaCl 浓度为0，0.25，0.5，0.75，1.0 mol/L 条件下MP 磷酸化程度。

1.2.5.4 反应时间的确定 称取一定量MP，pH由1.2.5.1 节确定，蛋白质质量浓度由1.2.5.2 节确定，NaCl 浓度由1.2.5.3 节确定，设置STP 含量为2%，考察反应时间为1，1.5，2.0，2.5，3.0 h 条件下MP 磷酸化程度。

1.2.5.5 STP 含量的确定 称取一定量MP，pH 由1.2.5.1 节确定，蛋白质质量浓度由1.2.5.2 节确定，NaCl 浓度由1.2.5.3 节确定，反应时间由1.2.5.4 节确定，考察STP 含量为1%，2%，3%，4%和5%条件下MP 磷酸化程度。

1.2.6 响应面优化试验 根据单因素试验结果，利用Box-behnken 设计原理，以pH 值（X1）、蛋白质质量浓度（X2）、STP 含量（X3）为变量，展开3 因素3 水平的响应面试验，因素与水平设计见表1。采用F 检验对试验结果进行方差分析以评价模型的统计意义。数据分析软件采用Design-Expert 8.0.6.1。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平Table 1 Box-Behnken experimental design factors and levels

1.2.7 最佳条件验证试验 利用Design-Expert 8.0.6.1 软件获得各个因素的最佳条件组合，结合实际可操作性进行适当修正，在修正后的条件下进行3 次验证试验。

1.2.8 模拟实际加工流程 根据响应面试验结果，模拟肉制品实际加工流程。将鸡胸肉剔除可见的脂肪结缔组织，用刀斩碎成肉糜，与三聚磷酸钠试剂混合均匀，置于4 ℃条件下反应12 h，反应结束后提取MP，测定磷酸化程度。

1.2.9 多酚协同磷酸化对MP 凝胶特性的影响选用易溶于水的绿原酸和没食子酸进行试验。根据1.2.5.3 节确定的NaCl 浓度溶解绿原酸或没食子酸。磷酸化MP 溶液分别与一定体积的绿原酸或没食子酸反应，使绿原酸或没食子酸的最终质量浓度依次为0，50，100，150，200，250 μg/mL，充分搅拌均匀，在磁力搅拌器作用下低速反应4 h。

1.2.10 凝胶性能的测定

1）热诱导凝胶制备 取20 mL 不同条件处理的蛋白于50 mL 烧杯中，在水浴锅中，以1 ℃/min的升温速度从20 ℃升至75 ℃，到达75 ℃后继续加热30 min。加热结束后，立即将样品放入冰水混合物中冷却30 min，然后放入4 ℃冰箱过夜。测定凝胶性能之前，将凝胶样品从冰箱中取出放在室温下平衡2 h。

2） 凝胶硬度和弹性测定 将待测凝胶样品置于测试平台上固定，室温条件下利用TA-XT Plus 型质构仪进行测定。测定模式设置为测前速率2 mm/s，测试速率1 mm/s，测后速率1 mm/s，下压距离为5 mm，引发力5 g，探头型号P/0.5。每个样品做3 组平行。

3） 凝胶白度测定 待测凝胶样品的色差值采用全自动便携式色差计测定，记录L*、a*和b*值，每个样品测定3 次，取其平均值。凝胶白度值根据式（1）计算[14]。

4） 凝胶保水性测定 参照Foegeding 等[15]的方法，取凝胶在10 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min 根据式（2）计算凝胶的保水性。

式中，m0——离心管质量，g；m1——离心管与凝胶在离心前的质量和，g；m2——离心管与离心去掉水以后的凝胶的质量和，g。

1.3 数据处理

通过Design Expert 8.0 软件设计响应面分析，采用软件Excel 2010 对数据进行统计分析并作图，并通过SPSS 16.0 对试验数据进行显著性检验。

图1 pH 值对MP 磷酸化程度的影响Fig.1 Effect of pH on phosphorylation of MP

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程的建立

根据双缩脲法得到的蛋白质含量的标准曲线回归方程为：Y=0.0476X+0.0091，R2=0.9998，式中，Y——吸光度；X——蛋白含量，mg/g；根据钼蓝比色法得到的磷酸根标准曲线回归方程为：Y=8.5617X-0.0172，R2=0.9999，式中，Y——吸光度，X——磷酸根标准液质量浓度，mg/mL。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 pH 值的确定 由图1可知，当pH 值为7.5时，鸡胸肉MP 磷酸化程度最大，达到了92.1 mg/g，磷酸化修饰效果最佳。反应pH 由7.0 升至9.0时，鸡胸肉MP 磷酸化程度出现了先增大后减小的趋势。可能的原因是蛋白在弱碱性条件下，氨基的活性较大，更易与磷酸根结合反应[16]。随着碱性增强，蛋白质变性程度加深，使得氨基不利于与磷酸根结合，导致磷酸化程度降低[17]。

2.2.2 蛋白质质量浓度的确定 由图2可知，当蛋白质质量浓度为15 mg/mL 时，鸡胸肉MP 磷酸化程度最大，达到了93.2 mg/g，磷酸化修饰效果最佳。蛋白质质量浓度由10 mg/mL 上升至30 mg/mL时磷酸化程度呈现先增大后减小的趋势。这可能是由于随着蛋白质质量浓度的增加，参与反应的蛋白质增多，因此磷酸化修饰效果增强；随着蛋白质质量浓度进一步增大，反应体系变得更加粘稠，使蛋白质与磷酸化试剂反应不完全，磷酸化修饰效果下降，磷酸化程度降低。

图2 蛋白质质量浓度对MP 磷酸化程度的影响Fig.2 Effect of protein mass concentration on phosphorylation of MP

2.2.3 NaCl 浓度的确定 由图3可知，当NaCl浓度为0.75 mol/L 时，MP 的磷酸化程度为97.6 mg/g，此时磷酸化修饰效果最好。当NaCl 浓度由0增加至1 mol/L 时，磷酸化程度先上升至97.6 mg/g，再下降至57.8 mg/g。可能的原因是MP 属于盐溶性蛋白，当NaCl 浓度逐渐增加时，MP 溶解度增加[18]，分子膨胀，使磷酸化反应更充分；当NaCl 浓度过高时，蛋白质可能会发生盐析效应[19]，导致磷酸化程度下降。

2.2.4 反应时间的确定 由图4可知，随着反应时间的延长，磷酸化程度呈上升趋势。反应时间在1 h 到2 h 之间时，反应更充分，磷酸化程度上升迅速；继续延长反应时间，蛋白磷酸化已基本完全，磷酸化程度趋于平缓。考虑到实际生产加工的效率问题，选取反应2 h 为最优条件。

2.2.5 STP 用量的确定 由图5可知，STP 用量为3%时，MP 磷酸化程度最高。STP 含量为1%～3%时，磷酸化程度随着STP 含量的增加而升高；STP含量大于3%时，磷酸化程度随之下降。这可能是由于STP 用量不断升高达到磷酸根饱和，使得能与磷酸根结合的特定氨基酸基团减少；另一方面，继续增加STP 用量，磷酸根基团数量增加，蛋白质分子间的静电斥力加大，阻碍反应继续进行，从而导致磷酸化程度降低[9，12]。

2.3 响应面优化

根据单因素试验结果，NaCl 浓度和反应时间对MP 磷酸化程度的影响没有其它3 个因素显著。以反应pH、蛋白质质量浓度、STP 含量为变量，进行3 因素3 水平的响应面试验。

鸡胸肉MP 磷酸化工艺条件优化根据Box-Behnken 试验设计了17 组试验，5 组为中心点重复试验，如表2所示。本试验以磷酸化程度作为响应值，利用Design-Expert 8.0.6.1 软件对磷酸化程度Y 进行多元回归拟合。得二次多项式拟合方程为：Y=97.736+1.715X1+2.9925X2+9.3725X3-3.145X1X2-0.97X1X3+0.07X2X3-16.2455X12-20.2005X22-11.7205X32。

回归模型的显著性检验和方差分析见表3。由表3可知，该模型的F 值为70.27，P ＜0.0001，表明模型极显著。失拟项的F 值为2.37，P =0.2113 ＞0.05，故失拟项不显著，模型选择合适。回归模型决定系数R2= 0.9891，矫正决定系数R2Adj=0.9750，说明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以通过该回归方程确定鸡胸肉MP 磷酸化的最佳工艺条件。

图3 NaCl 浓度对MP 磷酸化程度的影响Fig.3 Effect of NaCl concentration on phosphorylation of MP

图4 反应时间对MP 磷酸化程度的影响Fig.4 Effect of reaction time on phosphorylation of MP

图5 STP 含量对MP 磷酸化程度的影响Fig.5 Effect of STP content on phosphorylation of MP

方差分析表明，蛋白质质量浓度对磷酸化程度的影响显著，STP 含量对磷酸化程度的影响极显著。从各变量显著性检验P 值的大小，可以看出影响鸡胸肉MP 磷酸化的各因素按显著性排序依次为：STP 含量＞蛋白质质量浓度＞pH。pH 值平方项、蛋白质质量浓度平方项、STP 含量平方项对磷酸化程度的影响极显著。

表2 Box-Behnken 试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根据回归方程，做出三维响应面图及等高线图，三维响应面图可以显示响应面的变化趋势和最大值点。如果一个响应曲面坡度相对平缓，就表明因素对响应值的影响较小；相反，如果一个响应曲面坡度非常的陡峭，就表明响应值对于因素改变非常敏感。等高线图表示在同一椭圆形区域内，磷酸根含量是相同的；在椭圆形区域中心，磷酸根含量最高，由中心向边缘逐渐减少；图中椭圆排列越密集，说明因素变化对磷酸根含量影响越大；同时等高线的形状可反映交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著；而圆形则与之相反，表示此时两因素交互作用可忽略[20]。

图6～8 可以看出，对比其它两个因素间的交互作用，pH 与蛋白质质量浓度的交互作用更显著，具体表现为等高线图形较扁平。由图6可以看出，pH 与蛋白质质量浓度对磷酸化程度均有影响，二者均呈二次曲线形式。随着pH 值或蛋白质质量浓度的增加，磷酸化程度先增大后减小，说明pH 值和蛋白浓度之间有显著的协同作用，二者的协同作用可能会影响磷酸化程度。

图6 pH 和蛋白质质量浓度的响应面和等高线图Fig.6 Responsive surfaces and contour of the combined effects of pH and protein mass concentration

图7 pH 和STP 含量的响应面和等高线图Fig.7 Responsive surfaces and contour of the combined effects of pH and content of STP

图8 蛋白质质量浓度和STP 含量的响应面和等高线图Fig.8 Responsive surfaces and contour of the combined effects of protein mass concentration and content of STP

2.4 验证试验结果

根据Box-Behnken 试验所得出的结果以及二次多项式回归方程，再利用Design-Expert 8.0 软件获得了磷酸化条件的最佳因素组合为：pH 7.52，蛋白质质量浓度15.36 mg/mL，STP 含量3.40%，NaCl 浓度0.75 mol/L，反应时间2 h。此时预测的磷酸化程度为99.74 mg/g。为检验模型预测的准确性，选取pH 7.52，蛋白质质量浓度15.36 mg/mL，STP 含量3.40%，NaCl 浓度0.75 mol/L，反应时间2 h 为反应条件，进行3 组平行试验进行验证，得到的磷酸化程度为99.001 mg/g，本次结果与最佳理论条件下所得结果误差均在1%以内。由此可见，采用响应面法优化鸡胸肉MP磷酸化工艺是行之有效的。

2.5 肉品实际加工流程验证

在实际生产工艺中，磷酸盐作为添加剂直接添加到肉糜中。因此验证最优磷酸化条件是否也适用于肉品实际加工流程显得尤为重要。根据响应面试验结果，模拟设计肉品实际加工过程。设置STP 含量为3.40%，NaCl 浓度为0.75 mol/L，pH 7.52，STP 溶液体积在蛋白质质量浓度为15.36 mg/mL 的基础上，根据鸡胸肉质量确定反应时间为12 h。由图9可以看出，肉品实际生产过程中的磷酸化程度与试验流程相比略小，这可能是由于肉中还含有一定量的脂肪或其它物质，反应所需时间延长，反应不够彻底，导致三聚磷酸钠与肉中MP 的反应效率降低。由图9可知，两组数据差异不显著，这为今后磷酸化改性在肉品实际加工中的应用提供了理论依据，证明了磷酸化修饰的可行性。

图9 实际生产流程与试验流程磷酸化程度比较图Fig.9 Comparison of phosphorylation levels between actual production processes and experimental processes

2.6 磷酸化修饰对MP 凝胶特性的影响

采用水浴加热制备热诱导蛋白凝胶。在凝胶化过程中，蛋白质分子相互作用形成一个三维网络结构。由表4可以看出，经过STP 磷酸化改性后，鸡胸肉MP 的凝胶硬度、回复性、凝胶白度和凝胶保水性均有所提高。经过磷酸化改性，蛋白凝胶硬度减小了31.94%，弹性提高了6.9%，凝胶白度提高了5.14%，凝胶保水性提高了15.63%。这是因为磷酸化后引入大量磷酸根，改变了蛋白电荷的密度，提高了体系的离子强度，并使其偏离等电点，使电荷之间相互排斥，在蛋白质之间产生更大的空间，减缓了蛋白变性阶段的凝聚，使凝胶硬度下降[21]。多聚磷酸盐可以最大限度提高蛋白质的持水性是因为其能使MP 分子变性膨胀，溶胀形成3 个尺寸的蛋白质网络，从而使得蛋白凝胶具有高保水性[22-23]。

图10 磷酸化及未磷酸化MP 凝胶特性Fig.10 Gel properties of phosphorylated and unphosphorylated MP

2.7 多酚协同磷酸化对MP 凝胶特性的影响

在肉制品生产加工过程中，MP 氧化是影响肉制品品质的重要因素。添加天然抗氧化剂是控制肉制品氧化的有效手段。据研究报道，磷酸盐除了可以提高蛋白的水合能力，还具有显著的金属离子螯合能力，使得被螯合的金属离子无法参与氧化反应，因此可以提高肉制品的氧化稳定性[24-25]。然而磷酸盐只能螯合金属离子，并不具备清除自由基的能力，单独使用抗氧化效果有限。多酚作为目前常用的天然抗氧化剂之一，被广泛应用于肉制品生产加工。因此，本试验旨在探讨两种天然多酚（绿原酸和没食子酸）协同磷酸化对MP 凝胶特性的影响，为实际生产加工提供理论基础。

2.7.1 质构特性的影响 由图11a 可知，随着多酚浓度的增大，凝胶硬度呈先增大后减小的趋势。多酚质量浓度为50～100 μg/mL 时，硬度变化不显著；质量浓度为150 μg/mL 时，硬度达到最大；质量浓度继续增加，硬度则出现明显下降。分析原因可能是低质量浓度的多酚对蛋白结构的影响较小，故凝胶硬度的变化不大[26]；而中质量浓度的多酚与磷酸化MP 的结合有利于蛋白结构适当展开及更多氨基酸残基的暴露，进而促进蛋白分子间二硫键及其它共价键的形成，有利于蛋白的相互作用和交联，使凝胶硬度缓慢增大；而高浓度绿原酸或没食子酸可能会破坏磷酸化MP 的结构，引起过多蛋白聚集体的形成，极大地屏蔽了参与反应的官能团，破坏了凝胶网络的形成[27]。

由图11b 可知，随着绿原酸或没食子酸的加入，磷酸化MP 凝胶的弹性变化不显著，而均在中质量浓度左右出现最大值，这与凝胶硬度的结果类似。中质量浓度的绿原酸或没食子酸与磷酸化MP 的结合提高了蛋白溶解性，利于相邻蛋白分子间的活性基团相互作用，使凝胶弹性增大。

图11 不同多酚质量浓度对磷酸化MP 凝胶质构的影响Fig.11 The effect of polyphenols at different mass concentration on gel texture of phosphorylated MP

2.7.2 凝胶白度的影响 由图12可知，随着绿原酸质量浓度的增大，凝胶白度出现先减小后增大的趋势。曹云刚[27]研究发现，低浓度绿原酸对于羟自由基诱导的MP 凝胶白度影响不大，而中高浓度显著降低凝胶白度。这与本试验结果有所差异，可能是因为本文的研究对象是磷酸化后的MP，没有建立氧化体系而且添加多酚质量浓度也有较大差异所致。在本试验中，添加中质量浓度绿原酸时，由于绿原酸本身容易被氧化，造成颜色变化，故导致凝胶白度下降。随着绿原酸质量浓度增大，破坏凝胶网络结构，导致组织间自由水分含量增加，引起凝胶表面亮度值L*增大，使得凝胶白度有所升高[28]。这与本试验凝胶硬度的变化原因一致。观察图12可知，添加中高质量浓度的没食子酸使磷酸化MP 凝胶白度显著降低，且随着没食子酸质量浓度的增加，白度值呈下降趋势。这是因为没食子酸与磷酸化MP 反应呈现颜色变化，没食子酸质量浓度越高，二者反应下的蛋白溶液墨绿色变化越显著，热凝胶的白度值降低越明显。

2.7.3 凝胶保水性的影响 由图13可知，随着绿原酸或没食子酸质量浓度的增大，凝胶保水性均呈逐渐增大的趋势。其中，多酚的质量浓度为50～150 μg/mL 时，保水性变化不显著，这与本研究中低、中质量浓度多酚对凝胶硬度的影响一致；当多酚的质量浓度为200～250 μg/mL 时，凝胶保水性显著增大。分析原因可能是多酚的酚羟基及羧基进一步提升了蛋白表面的亲水性。因此随着多酚质量浓度的增加，保水性随之增大。张慧芸等[29]报道向猪肉MP 中添加没食子酸能提高其凝胶保水性。

图12 不同多酚质量浓度对磷酸化MP 凝胶白度的影响Fig.12 The effect of polyphenols at different mass concentration on gel whiteness of phosphorylated MP

图13 不同多酚浓质量度对磷酸化MP 凝胶保水性的影响Fig.13 The effect of polyphenols at different mass concentration on gel water retention of phosphorylated MP

3 结论

本文通过单因素试验和响应面优化，得到鸡胸肉MP 磷酸化的最佳工艺条件为：pH 7.52、蛋白质质量浓度15.36 mg/mL，NaCl 浓度0.75 mol/L，反应时间2 h，STP 含量3.40%。在此条件下得到的磷酸化程度为99.001 mg/g。模拟肉品实际加工流程得到的蛋白磷酸化程度与试验结果比较接近，证明了磷酸化修饰的可行性。磷酸化MP 的凝胶弹性、白度和保水性均有不同程度提高，说明磷酸化可以改善蛋白的凝胶特性。多酚协同磷酸化对蛋白凝胶特性的影响表明，相较于绿原酸，没食子酸对凝胶特性各方面的影响更显著。随多酚质量浓度的增加，凝胶硬度先增大后减小；凝胶弹性随质量浓度的变化不明显；凝胶白度随绿原酸质量浓度的增大呈先降低后增大的趋势，随没食子酸质量浓度的增大明显下降；凝胶保水性随多酚质量浓度的增大逐渐升高。本研究可为今后多酚与磷酸盐复配在鸡胸肉质构特性改善方面提供理论依据，为鸡胸肉的实际加工生产提供理论基础。