溃疡性结肠炎活动期患者结肠镜活检肠道菌群分布及与其相关白细胞介素水平变化的关联性

黄明静

河南省息县人民医院，河南 信阳 464300

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）属于慢性结肠炎性疾病，目前普遍认为其病因、发病机制与免疫功能异常、遗传易感因素、环境因素等多种因素间相互作用有关［1］。免疫应答紊乱、慢性炎性反应是导致UC关键病理环节，而导致炎性反应、免疫应答改变重要因素为肠道内菌群紊乱［2］。目前，针对UC患者肠道内菌群研究因选取疾病病程和分期不同、治疗与否所致分析方法不同，加之肠道内菌群复杂性，其完整结构、功能并未被完全了解，进而导致对肠道内需氧菌、常见厌氧菌变化认知不统一，也未能完全阐明其在疾病发生中具体作用［3］。本研究利用涂片镜检、免疫组化、细菌培养、real-time PCR等对UC活动患者、健康体检者的菌群进行分析，并将IL-23、IL-17与目标菌群相关性进行分析。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取河南省息县人民医院于2018年3月—2019年9月间UC活动期患者56例为研究组，选同期健康体检者63例作为对照组。研究组，男性27例，女性29例，年龄25～71岁，平均年龄（48.03±11.46）岁，病程1～15年，平均病程（8.01±3.47）年；对照组，男性30例，女性33例，年龄25～72岁，平均年龄（48.47±11.73）岁，均已签署知情同意书。两组一般资料（年龄、性别）差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核同意。

1.2 纳入标准及排除标准

（1）纳入标准：患者均符合《溃疡性结肠炎中西医结

合诊疗共识意见（2017年）》［4］中关于活动期UC诊断标准者；临床资料完整者。（2）排除标准：合并心、肺、肾、肝等严重疾病者；伴有糖尿病严重者；伴有严重感染者；伴有UC并发症者；哺乳期、妊娠期女性；伴有肠外表现者；伴有其他自身免疫疾病者。

1.3 方法

1.3.1 涂片镜检：取新鲜粪便标本，2 h常规涂片，干燥固定后予以革兰染色，于油镜下对10个视野进行观察，依据油镜视野内细菌综合素质、细菌比例，确认是否发生菌群失调和失调程度。

1.3.2 细菌培养鉴定：采用10μl接种环对新鲜粪便进行挑取，利用4区划线法接种。（1）厌氧培养：于厌氧血平板上进行接种，于37℃的无氧环境中孵育48 h，取优势菌行耐氧实验，利用API20A厌氧菌鉴定卡对专性厌氧菌鉴定；（2）需氧培养：于血平板、中国蓝平板上进行接种，在浓度为5%CO2、37℃的有氧环境中进行24 h孵育，采用全自动细菌鉴定仪对优势菌的菌种进行鉴定；（3）选择性培养基：接种拟杆菌、大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌选择性培养基培养。

1.3.3 real-time PCR荧光定量分析：将涂片、培养剩余标本置于-80℃保存，利用粪便DNA组提取试剂盒抽提粪便总DNA，测定其DNA浓度后，保存至-20℃；利用real-time PCR试剂盒扩增粪便DNA，将每个标本行复孔检测。

1.3.4 免疫组化法对结肠组织中的IL-23、IL-17表达进行检测：切片脱蜡直至水化，采用3%H2O2将内源性过氧化物酶进行阻断，采用微波将抗原修复，分别和IL-17、IL-23Ⅰ抗在4℃下孵育过夜，将辣根过氧化物酶、Ⅱ抗对链霉卵白素工作液进行标记，DAB进行显色，其中棕褐色的反应产物为抗原定位。

1.3.5 Baron分级、结肠组织病理学分析：（1）Mayo评分：评价疾病活动度，症状减轻为＜2分，轻度活动期3～5分，中度活动期为6～10分，中度活动期为11～12分；（2）内镜下活动度分级：依据改良Baron分级；（3）结肠组织病理学评分：对肠黏膜组织行常规石蜡切片，并予以HE染色，与光镜下对肠黏膜溃疡形成、炎性细胞浸润、水肿、充血等状况进行观察，依据Siegmund等评分法进行评分。每个标本取5张切片，每个切片随机选4个视野。

1.4 观察指标

（1）镜检、细菌培养鉴定、real-time PCR的荧光定量分析。（2）IL-17、IL-23表达和Baron分级、结肠组织病理学评分相关性分析。（3）IL-17、IL-23表达和菌群荧光定量相关性分析。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料用例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验，并行Spearman相关分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组镜检、细菌培养、real-time PCR的荧光定量结果

与对照组对比，研究组球菌数量上升，杆菌数量降低，且菌群失调度升高，Ⅱ度、Ⅲ度失调比例由对照组10%、0升至研究组的30%、25%；厌氧菌、需氧菌均有改变，其中厌氧菌总数减少，主要表现在拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌减少，需氧菌总数上升，表现在大肠杆菌减少、肠球菌升高。

2.2 IL-17、IL-23表达和Baron分级、结肠组织病理学评分相关性

经Spearman分析，IL-23、IL-17与Baron分级（r23=0.850，r17=0.718）、结肠组织病理学评分（r23=0.676，r17=0.659）呈正相关（P＜0.05），见表1。

表1 IL-17、IL-23表达和Baron分级、结肠组织病理学评分相关性

2.3 IL-17、IL-23表达和菌群荧光定量相关性分析

经Spearman分析，IL-23与大肠杆菌数呈负相关（r=-0.701）、与肠球菌数呈正相关（r=0.873），IL-17与肠球菌数呈正相关（r=0.765，P＜0.05），见表2。

表2 IL-17、IL-23表达和菌群荧光定量相关性分析

3 讨论

肠道菌群可构成复杂的肠道微生态系统，在机体肠道免疫系统、抑制致病菌、营养位置吸收合成等方面具有重要作用［5］。研究认为，UC发病原因为肠黏膜的屏障功能产生异常，肠道内菌群紊乱、异常免疫反应介导间互相作用，导致肠黏膜功能出现异常，其参与UC发病。目前发现多种类病毒、细菌等参与炎性肠病发病［6］。基于分析方法不同，UC活动期肠道菌群构成研究结果不同。

本研究对各组标本予以粪便涂片、厌氧和需氧菌培养，结果显示，厌氧菌、需氧菌均有改变，其中厌氧菌总数减少，主要表现在拟杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌减少，需氧菌总数上升，表现在大肠杆菌减少、肠球菌升高。这一结果与王艳等［7］研究结果类似，大致揭示在UC活动期内肠道菌群分布状况。正常状况下，乳酸杆菌、双歧杆菌和肠黏膜细胞可密切结合，于肠黏膜表面生成生物学屏障，进而阻止致病菌的入侵，而二者减少可降低肠黏膜防御功能。肠球菌可释放外毒素，进而加重已存在的免疫紊乱和炎性反应，但具体作用机制仍需进一步研究。本研究结果显示，经Spearman分析，IL-23、IL-17与Baron分级、病理学组织评分呈正相关，且IL-23与大肠杆菌数呈负相关、与肠球菌数呈正相关，IL-17与肠球菌数呈正相关，说明IL-17、IL-23在UC活动期发生、发展均具有关键性作用。最新研究显示，以分泌IL-17为特征CD4+T细胞属于新型辅助T淋巴细胞亚群，其具有介导免疫性疾病、炎性反应等免疫调节重要作用［8］。肠道内的致病菌产物和各自Toll样受体发生结合，可诱导抗原细胞分泌IL-23，而IL-23和相应受体相结合，继而诱导IL-17表达，进而促进炎性级联放大，从而介导肠道炎性反应、肠黏膜损伤。本研究具有一定局限性，细菌培养仅能检测肠道内活菌，无法代表死菌，且肠道内菌群种类繁多，无法反映所有菌群，且在分析过程中仅涉及现有条件下具有代表性菌种。

综上所述，UC活动期患者具有明显菌群失衡，且菌群改变与疾病炎性程度具有密切联系，IL-23、IL-17与肠道内菌群含量变化具有较强的关联性，在UC发生中起重要作用，属于UC关键因子。