血清HBcrAg在慢性乙型肝炎病毒感染自然史中的变化

陆 伟，王雁冰，张占卿，黄 丹，李秀芬，周新兰，丁荣蓉，曾 东，冯艳玲

上海市公共卫生临床中心 1.肝胆内科； 2.病理科，上海 201508

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染依次经历乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)阳性和阴性两个阶段；无论HBeAg阳性或阴性阶段，均先后经历肝炎活动期和非活动期[1-4]。迄今为止，大多数慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)实践指南将血清HBV DNA载量和血清丙氨酸转移酶水平或肝脏组织学评价作为识别活动期和决定实施抗病毒治疗的主要参考指标[1-4]。最近有研究显示，血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和乙型肝炎核心抗体(hepatitis B core antibody，anti-HBc)水平也可作为鉴别非活动期与活动期的重要指标[5-9]。

血清乙型肝炎核心相关抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)是HBeAg、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)和乙型肝炎核心相关蛋白p22cr的变性混合物[10-11]，其中，p22cr主要存在于HBV DNA阴性和HBcAg缺乏的Dane样颗粒(Dane-like particles)中[12]。最近有研究发现，血清HBcrAg水平在慢性HBV感染自然史不同分期之间也存在差异[13-14]。本文旨在通过与其他血清病毒学指标比较，进一步探讨血清HBcrAg在慢性HBV感染自然史不同分期之间的差异及其对HBeAg阳性和阴性慢性HBV感染患者活动期的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2012年1月至2015年6月上海市公共卫生临床中心经历肝脏活检的初治慢性HBV感染患者492例。其中，HBeAg阳性292例，男189例，女103例，年龄(34.29 ±10.49)岁(14～72岁)；HBeAg阴性200例，男124例，女76例，年龄(42.80±11.56)岁(17～72岁)；HBeAg阳性与阴性患者性别比例的差异无统计学意义(χ2=0.272，P=0.6017)，年龄差异有统计学意义(t=8.474，P<0.0001)。参照中华医学会肝病学分会、感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》(2015更新版)[3]，结合肝脏组织学评价，HBeAg阳性感染患者分别有49例和243例被诊断为非活动期和活动期；HBeAg阴性感染者分别有101例和99例被诊断为非活动期和活动期。合并其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、遗传性肝病、血吸虫性肝病和内分泌与代谢疾病、血液系统疾病的患者被排除。本研究得到了上海市公共卫生临床中心伦理委员会的批准，研究过程遵循Helsinki宣言。

1.2 实验室检查血清HBcrAg采用化学发光酶免疫法和Lumipulse G1200全自动化学发光免疫分析仪(Fujirebio Inc.)及其配套试剂(批号：SAX5031，日本)检测；检测范围1～10 000 kU/ml，如超过检测上限，血清被稀释100倍重新检测。血清HBsAg和HBeAg采用化学发光微粒子免疫法和Architect I2000全自动化学发光免疫分析仪(Abbott Laboratories)及其配套试剂检测；其中，HBsAg检测范围0.05～250 IU/ml，如超过检测上限，血清被稀释500倍重新检测；HBeAg检测检测下限为1 s/CO。血清HBV DNA采用Bio-Rad Icycler PCR系统(Bio-Rad Laboratories, Inc.)检测，试剂盒购自QIAGEN生物工程(深圳)有限公司；检测范围5×102～5×107IU/ml。

1.3 肝脏组织学评价所有患者在接受肝活检前常规签署知情同意书。肝脏活检采用1 s经皮肝穿刺法。标本采集后立即置塑料标本管内冰冻送检。肝脏标本的质量评价和肝脏病理学诊断由1名有经验的病理学医师独立完成。肝脏病理学诊断采用Scheuer评分系统[15]，肝脏病理学分级包括G0～G4五级，分期包括S0～S4五期。肝脏HBsAg和HBcAg采用免疫组化法检测。肝脏HBsAg和HBcAg表达水平分为四级：-(无阳性细胞)、+(阳性细胞<25%)、++(阳性细胞25%～49%)、+++(阳性细胞≥50%)。

1.4 统计学分析采用Medcalc 15.8软件进行统计分析。HBeAg阳性和阴性患者非活动期与活动期血清病毒学指标之间的差异比较采用两独立样本Mann-WhitneyU检验，非活动期与活动期肝脏HBsAg和HBcAg不同表达水平构成比之间的差异比较采用Pearsonχ2检验。血清HBcrAg与血清和肝脏其他病毒学指标之间的相关性采用Spearman相关分析。血清HBcrAg和其他病毒学指标预测HBeAg阳性和阴性患者活动期的性能评价采用ROC曲线法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非活动期与活动期血清和肝脏病毒学指标不同比例之间的差异比较HBeAg阳性患者，非活动期和活动期血清HBcrAg高于100倍检测上限的比例分别为0(0/49)和0.82%(2/243)，HBsAg高于超过稀释500倍检测上限的比例分别为12.24%(6/49)和5.76%(14/243)，HBV DNA高于超过检测上限的比例分别为71.43%(35/49)和37.45%(91/243)；非活动期与活动期血清HBcrAg、HBsAg、HBeAg和HBV DNA之间的差异均有统计学意义(P<0.0001)。非活动期和活动期肝脏HBsAg水平-、+、++、+++的构成比分别为0(0/49)、18.37%(9/49)、51.02%(25/49)、30.61%(15/49)和2.06%(5/243)、22.22%(54/243)、34.98%(85/243)、40.74%(99/243)，HBcAg水平-、+、++、+++的构成比分别为26.53%(13/49)、36.73%(18/49)、36.73%(18/49)、0(0/49)和62.55%(152/243)、28.40%(69/243)、9.05%(22/243)、0(0/243)；非活动期与活动期肝脏HBsAg不同水平构成比之间的差异无统计学意义(P=0.1614)，HBcAg不同水平构成比之间的差异有统计学意义(P<0.0001)；其中，非活动期肝脏HBcAg≥+的比例显著高于活动期(χ2=16.970，P<0.0001)(见表1、图1)。

HBeAg阴性患者，非活动期和活动期血清HBcrAg低于检测下限的比例分别为61.39%(62/101)和7.07%(7/99)，HBsAg低于检测下限的比例分别为0(0/101)和0(0/99)，HBV DNA低于检测下限的比例分别为51.49%(52/101)和0(0/99)；非活动期与活动期血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA之间的差异均有统计学意义(P<0.0001、P=0.0477、P<0.0001)。非活动期和活动期肝脏HBsAg水平-、+、++、+++的构成比分别为12.87%(13/101)、40.59%(41/101)、30.69%(31/101)、15.84%(16/101)和4.04%(4/99)、22.22%(22/99)、45.45%(45/99)、28.28%(28/99)，HBcAg水平-、+、++、+++的构成比分别为96.04%(97/101)、2.97 %(3/101)、0.99%(1/101)、0(0/101)和91.92%(91/99)、7.07%(7/99)、1.01%(1/99)、0(0/99)；非活动期与活动期肝脏HBsAg不同水平构成比之间的差异有统计学意义(P=0.0005)，HBcAg不同水平构成比之间的差异无统计学意义(P=0.4031)；其中，非活动期肝脏HbsAg≥+和≥++的比例分别显著高于和显著低于活动期(χ2=140.703，P<0.0001和χ2=33.612，P< 0.0001)(见表1、图1)。

表1 HBeAg阳性和阴性患者非活动期与活动期血清和肝脏病毒学指标之间的差异比较Tab 1 Comparison of virological indexes between active and active serum and liver in patients with positive and negative HBeAg

注：M：中位值：IQR：四分位距。a:两独立样本Mann-WhitneyU检验； b: Pearsonχ2检验。

2.2 HBeAg阳性与阴性阶段血清和肝脏病毒学指标之间的差异比较非活动期患者，HBeAg阳性与阴性血清HBsAg、HBcrAg和HBV DNA之间的差异均有统计学意义(Z=9.616，P<0.0001;Z=10.246，P<0.0001和Z=10.178，P<0.0001)；肝脏HBsAg和HBcAg不同水平构成比之间的差异均有统计学意义(χ2=18.331，P=0.0004和χ2=81.884，P<0.0001)；其中，HBeAg阳性肝脏HBsAg≥+和≥++的比例均显著高于HBeAg阴性(Fisher精确检验，P=0.005和χ2=16.685，P<0.0001)，HBeAg阳性肝脏HBcAg≥+和≥++的比例均显著高于HBeAg阴性(χ2=81.515，P<0.0001和χ2=38.107，P<0.0001)(见表1、图1)。

活动期患者，HBeAg阳性与阴性血清HBsAg、HBcrAg和HBV DNA之间的差异均有统计学意义(Z=7.915，P<0.0001;Z=12.028，P< 0.0001和Z=9.073，P<0.0001)；肝脏HBsAg和HBcAg不同水平构成比之间的差异分别为无统计学意义和有统计学意义(Fisher精确检验，P=0.1264；χ2=29.699，P<0.0001)；HBeAg阳性肝脏HbcAg≥+和≥++的比例均显著高于HBeAg阴性(χ2=29.496，P<0.0001，χ2=29.496，P<0.0001)(见表1、图1)。

2.3 血清HBcrAg与血清和肝脏其他病毒学指标的相关性HBeAg阳性患者，非活动期血清HBcrAg与血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA均呈显著正相关(P<0.05)，与肝脏HBsAg和HBcAg均无显著相关性(P>0.05)；活动期血清HBcrAg与血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA均呈显著正相关(P<0.0001)，与肝脏HBsAg和HBcAg均呈显著正相关(P<0.005，见表2)。

HBeAg阴性患者，非活动期血清HBcrAg与血清HBsAg和HBV DNA分别呈显著正相关(P<0.0001)和无显著相关性(P=0.1589)，与肝脏HBsAg和HBcAg分别呈显著正相关(P<0.0001)和无显著相关性(P=0.7569)；活动期血清HBcrAg与血清HBsAg和HBV DNA均呈显著正相关(P<0.05)，与肝脏HBsAg和HBcAg均无显著相关性(P>0.05，见表2)。

注：自然分期(phase)：1代表HBeAg阳性非活动期；2代表HBeAg阳性活动期；3代表HBeAg阴性非活动期；4代表HBeAg阴性活动期。A：HBcrAg；B：HBsAg；C：HBeAg；D：HBV DNA。图中中间水平线代表中位值，上下两条水平线代表四分位距。

观察变量 例数血清HBsAg血清HBeAg血清HBV DNA肝脏HBsAg肝脏HBcAgHBeAg阳性非活动期 49rs0.4310.4110.291-0.0930.112P值0.00200.00330.04210.52660.4456 活动期 243rs0.6170.7440.5780.2000.390P值<0.0001<0.0001<0.00010.0018<0.0001HBeAg阴性 非活动期 101rs0.433—0.1410.393-0.0312P值<0.0001—0.1589<0.00010.7569 活动期 99rs0.216—0.6510.0500.124P值0.0320— <0.00010.62530.2256

2.4 血清HBcrAg预测HBeAg阳性和阴性患者活动期的性能HBeAg阳性患者，血清HBsAg预测活动期的AUROC最大且显著大于血清HBcrAg和HBV DNA预测活动期的AUROC(P<0.05，见表3、图2)。

HBeAg阴性患者，血清HBsAg预测活动期的AUROC最小且显著小于血清HBcrAg和HBV DNA预测活动期的AUROC(P<0.0001)，血清HBV DNA预测活动期的AUROC最大且显著大于血清HBcrAg预测活动期的AUROC(见表3、图2)。

血清HBcrAg、HBsAg、HBeAg和HBV DNA预测HBeAg阳性患者活动期的最佳截断值分别为≤5.156 log10 KU/ml、≤4.276 log10 IU/ml、≤3.007 log10 s/CO和≤7.599 log10 IU/ml；血清HBcrAg和HBV DNA预测HBeAg阴性患者活动期的最佳截断值分别为>1.428 log10 kU/ml、>3.942 log10 IU/ml(见表4)。

表3 血清病毒学指标预测HBeAg阳性和阴性患者活动期的AUROCTab 3 AUROC for predicting the active period of HBeAg-positive and negative patients by serum virologic index

注：AUROC：ROC曲线下面积；SE：标准误。a：Z=2.072，P=0.0383；b：Z=3.115，P=0.0018；c：Z=7.168，P<0.0001；d：Z=4.128，P<0.0001；e：Z=9.837，P<0.0001。

图2 血清病毒学指标预测HBeAg阳性和阴性患者活动期的ROC曲线 A：预测HBeAg阳性患者活动期；B：预测HBeAg阴性患者活动期Fig 2 ROC curve of serum virological index predicting active stage of HBeAg positive and negative patients A: predicting active stage of HBeAg positive patients; B: predicting active stage of HBeAg negative patients

测试变量HBeAg阳性Cut-offSen /%Spe /%+LR-LR+PV /%-PV /%AccHBeAg阴性Cut-offSen /%Spe /%+LR-LR+PV /%-PV /%AccHBcrAg (log10 kU/ml)≤5.15666.377.62.950.4493.631.70.61>1.42872.795.114.690.2993.578.00.84HBsAg (log10 IU/ml)≤4.27665.093.910.620.3798.135.10.65>2.35986.939.61.440.3358.575.50.61HBeAg (log10 s/CO)≤3.00767.579.63.310.4194.333.10.63———————HBV DNA (log10 IU/ml)≤7.59960.579.62.960.5093.628.90.58>3.94289.992.111.350.1191.890.30.91

注：Cut-off：最佳截断值；Sen:灵敏度；Spe：特异度；+LR：阳性似然比；-LR：阴性似然比；+PV：阳性预测值；-PV：阴性预测值；Acc：准确度。

3 讨论

30余年来，慢性HBV感染的自然史研究已取得许多进展[16-19]。虽然慢性HBV感染的自然史表现高度异质，但一般依次经历4个分期：HBeAg阳性非活动期和活动期到HBeAg阴性非活动期和活动期[20-24]。从宿主免疫与病毒的平衡状态来概念化慢性HBV感染的自然史的4个分期，通常分为免疫耐受期和免疫清除期/免疫激活期、免疫控制期/免疫再耐受期和免疫逃逸期/免疫再激活期[16-19]。事实上，慢性HBV感染的自然史由病毒、环境和宿主因素复杂的相互作用共同决定，其发病和进展的免疫学和病毒学机制均未阐明[25-27]。

SETO等[13]研究显示，慢性HBV感染自然史的4个分期与血清HBcrAg与HBsAg和HBV DNA均呈显著正相关；本文也有相似结果并与MAASOUMY等[14]的研究结果一致，仅HBeAg阴性患者非活动期血清HBcrAg与HBV DNA无显著相关性，其原因可能与血清HBcrAg与HBV DNA检测试剂的灵敏度有关，本文分别有61.39%和51.49%的患者，其血清HBcrAg与HBV DNA低于检测下限。但是，SETO等[13]和MAASOUMY等[14]的研究均未提及血清HBcrAg与肝脏HBsAg和HBcAg的相关性。本文结果显示，HBeAg阳性患者，非活动期血清HBcrAg与肝脏HBsAg和HBcAg均无显著相关性，活动期血清HBcrAg与肝脏HBsAg和HBcAg均呈显著正相关；HBeAg阴性患者，非活动期血清HBcrAg与肝脏HBsAg和HBcAg分别呈显著正相关和无显著相关性，活动期血清HBcrAg与肝脏HBsAg和HBcAg均无显著相关性。慢性HBV感染自然史不同分期血清HBcrAg与肝脏HBsAg和HBcAg相关性不一致的原因可能与肝脏HBsAg和HBcAg半定量计分方法的准确度有关，但本文未显示,血清HBcrAg与肝脏HBsAg和HBcAg呈显著负相关。提示在肝脏损伤和纤维化进展过程中，虽然HBeAg阳性与阴性患者血清和肝脏病毒学指标均呈反向演化；但无论HBeAg阳性或阴性，血清HBcrAg与其他血清和肝脏病毒学指标变化方向基本保持一致。

已发表文献和本文结果均显示，HBeAg阳性患者非活动期的血清病毒学指标均表现为最高水平；进入活动期后表现为差异化下降，其中，HBsAg的降幅最大，其次为HBeAg和HBcrAg，再次为HBV DNA。相反，HBeAg阴性患者非活动期的血清病毒学指标均表现为最低水平；进入活动期后表现为差异化上升，其中，HBV DNA升幅最大，其次为HBcrAg，再次为HBsAg[13-14, 28]。本文结果还显示，HBeAg阳性患者非活动期的肝脏HBsAg和HBcAg均表现为高表达，进入活动期后表现为差异化减少，其中，HBsAg有一定程度减少，但HBcAg减少更加突出；相反，HBeAg阴性患者非活动期的肝脏HBsAg和HBcAg分别表现为低表达和“零”表达，进入活动期后表现为HBsAg进一步减少。HBeAg阳性患者，非活动期肝脏HBsAg不同水平的构成比接近于活动期，但HBcAg≥+的比例显著高于活动期。HBeAg阴性患者，非活动期肝脏HBsAg≥+和≥++的比例分别显著高于和显著低于活动期，但HBcAg不同水平的构成比接近于活动期。非活动期患者，HBeAg阳性HBsAg≥+和≥++的比例显著高于HBeAg阴性，且HBcAg≥+和≥++的比例也显著高于HBeAg阴性；活动期患者，HBeAg阳性HBsAg不同水平的构成比接近于HBeAg阴性，但肝脏HBcAg≥+和≥++的比例显著高于HBeAg阴性。

HBeAg阳性与阴性患者血清和肝脏病毒学指标随肝脏损伤和纤维化进展呈反向演化和差异化表达的现象进一步提示，HBeAg阳性与阴性患者肝炎活动的病毒学机制可能存在差异，HBsAg可能有重要的免疫调节效应，而HBcAg可能是免疫应答的主要靶标[29]。因此可以假设：HBeAg阳性阶段，肝炎活动可能起因于HBsAg表达的自发性减少，导致首次激活主要针对HBcAg的免疫应答，进而导致肝脏损伤和纤维化进展，伴随HBV复制下降和抗原表达减少；首次免疫应答持续直到发生HBeAg显著减少或转换，并维持针对HBcAg的免疫应答和针对HBsAg的免疫耐受；HBeAg阴性阶段，肝炎活动可能起因于HBV复制的机会性增加，导致再次激活针对HBcAg的免疫应答，进而导致肝脏再损伤和纤维化再进展，伴随HBV复制再下降和抗原表达再减少；再次免疫应答持续直到发生HBsAg显著减少或转换，并维持针对HBcAg和HBsAg免疫应答。因此可以推断，慢性HBV感染自然史可以分为5个连续分期：针对HBsAg免疫耐受期、针对HBcAg的免疫激活期、针对HBsAg的再耐受期、针对HBcAg的免疫再激活期、针对HBsAg的免疫清除期。

本文ROC曲线分析显示，血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA对HBeAg阳性和阴性患者活动期均有显著的预测意义。其中，血清HBsAg和HBV DNA分别对HBeAg阳性和阴性患者活动期的预测效能最大；无论HBeAg阳性或阴性，血清HBcrAg对活动期的预测效能均介于血清HBsAg与HBV DNA之间，且分别显著低于血清HBsAg和HBV DNA。

总之，本文探讨了血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA在慢性HBV感染自然史中的变化。结果显示，HBeAg阳性慢性HBV感染，血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA从非活动期到活动期呈现差异化下降，其中，HBcrAg降幅分别小于HBsAg和大于HBV DNA；相反，HBeAg阴性慢性HBV感染，血清HBcrAg、HBsAg和HBV DNA从非活动期到活动期呈现差异化上升，其中，HBcrAg升幅分别大于HBsAg和小于HBV DNA。