BRAF V600E和TERT启动子突变与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系*

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺恶性肿瘤中最常见的病理类型，占全部甲状腺癌的80%以上[1]。近年来，国内外甲状腺癌的患病率不断攀升，绝大部分甲状腺癌恶性程度较低，进展缓慢，经规范化治疗后患者预后良好，但约10%的甲状腺癌具有高侵袭性的生物学行为[2]，早期即可侵犯喉返神经、气管和食管，并出现侧颈淋巴结转移，复发及死亡率高。对PTC患者进行个体化治疗，在早期及时干预以降低复发、死亡的风险和谨慎手术以避免术后相关并发症的出现之间找到平衡，是目前临床医师关注的重点。了解甲状腺癌的分子发病机制，筛选提示预后的分子标志物，对疾病进行风险分层可有效鉴别出预后较差的PTC患者，为选择精准的治疗方式提供依据。

BRAF基因突变发生于约29%～83%的甲状腺癌，是甲状腺恶性肿瘤中最常见的突变类型[3]。BRAF V600E突变激活RAS/RAF/促分裂原活化蛋白激酶途径从而引起细胞的恶性增殖，有研究认为携带BRAF V600E突变的PTC具有更高的侵袭性，提示肿瘤不良预后[4]。端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的催化亚基，通过激活端粒酶来保持端粒的完整，使肿瘤细胞获得无限增殖的能力[5]。TERT启动子突变是肿瘤特异性的体细胞突变，在正常组织中未发现表达。TERT启动子区域最常见的突变位点位于5号染色体1295228C＞T（C228T）和1295250C＞T（C250T）。有研究报道其与肿瘤侵袭性密切相关，在恶性黑色素瘤、脑胶质瘤、膀胱癌中均有表达[6]。在甲状腺癌中，TERT启动子突变更常见于未分化癌、间变癌以及BRAF V600E突变型PTC中。提示BRAF V600E突变和TERT启动子突变可能具有某种协同作用，形成独特的遗传背景，PTC具有更强的侵袭性。基于此，本研究回顾性分析728例PTC患者的BRAF V600E和TERT启动子突变情况，及其与临床病理特征的关系，以期了解甲状腺癌的分子发病机制，筛选提示预后的分子标志物，对疾病进行风险分层，为患者选择精准的治疗方式提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2014年12月至2016年12月共2 396例患者因甲状腺癌于山西省肿瘤医院行手术治疗。共728例PTC患者纳入本研究。纳入标准：1）初次行甲状腺癌手术；2）术后病理证实为甲状腺癌；3）可获取完整的临床病理学资料。排除标准：1）甲状腺转移癌；2）合并其他类型的甲状腺癌，如髓样癌、未分化癌等。

所有患者均接受甲状腺腺叶+峡部切除或全甲状腺切除，均行预防性或治疗性中央区淋巴结清扫，侧颈淋巴结仅行治疗性清扫。初次治疗后，728例患者均获得随访，截至2019年11月，随访时间为8～44个月。肿瘤直径、癌灶数量、腺外侵犯、中央区及侧颈淋巴结转移、病理亚型均由2位病理科医师独立报告，结果不一致时由第3位病理医师讨论并诊断。腺外侵犯定义为术中肉眼可见肿瘤侵犯带状肌、喉、气管、食管、喉返神经等和（或）镜下。肿瘤直径在多灶甲状腺癌中定义为最大癌灶的直径。肿瘤复发定义为组织学/细胞学/放射性碘显像证实的复发或肿瘤持续存在。随访时间的计算为从术后至发现肿瘤复发的时间间隔，无复发时从术后至最后一次随访的时间间隔。TNM分期的依据为美国癌症联合委员会（AJCC）第8版甲状腺癌分期。

1.2 DNA提取和突变分析

采用QIAGEN公司（德国）DNA FFPE Tissue Kit（QIAGEN）试剂盒提取新鲜PTC肿瘤组织DNA，严格按照说明书进行操作。采用紫外分光光度计测量DNA的浓度、纯度和波长在260 nm和280 nm的光密度（OD），经检验所有DNA样本的纯度均达到要求。

BRAF基因使用艾德生物（厦门）人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒检测突变，TERT基因使用艾德生物TERT突变检测试剂盒检测突变。使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7000）进行PCR扩增。反应条件：第1阶段95℃5 min，1个循环；第2阶段95℃25 s，64℃20 s，72℃20 s，15个循环；第3阶段93℃25 s，60℃35 s，72℃20 s，31个循环。第3阶段60℃时进行信号收集。样本Ct值≥28，样本为阴性；Ct值＜28，则样本为阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以表示，计数资料以百分率表示，采用χ2检验及Fisher 确切概率法进行单因素分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC患者中BRAF V600E、TERT C228T 及TERT C250T突变情况

本研究共纳入PTC研究对象728例，其中男性141例（19.4%），女性587例（80.6%）。年龄13～82岁，平均年龄（43.6±8.6）岁，其中年龄＜55岁567例（77.9%），≥55岁161例（22.1%）。平均肿瘤直径（1.58±0.25）cm，其中肿瘤直径≤2 cm 459例（63.1%），＞4 cm 36例（4.9%）。在所有PTC患者中，经典型617例（84.7%），滤泡亚型72例（9.9%），高柱状型21例（2.9%），弥漫硬化型18例（2.5%）。发生腺外侵犯204例（28.0%），其中侵犯颈前带状肌42例（5.8%），侵犯喉返神经22例（3.0%），侵犯食管/气管19例（2.6%）。多灶性甲状腺乳头状癌256例（35.2%），PTC合并桥本甲状腺炎276例（37.9%），中央区淋巴结转移240例（33.0%），侧颈淋巴结转移86例（11.8%）。随访或就诊时发现远处转移37例（5.1%），随访期间发现复发39例（5.4%），出现残余甲状腺腺叶复发22例（3.0%）。侧颈及中央区淋巴结复发27例（3.7%），其中患侧淋巴结转移19例（2.6%），对侧颈部淋巴结转移3例（0.4%），双侧颈淋巴结转移5例（0.7%），仅发生中央区淋巴结转移12例（1.6%）。随访期间1例患者死于乳腺癌伴多脏器转移，1例死于重症肺炎，2例死于心力衰竭，无患者死于PTC。

本研究728例患者中，BRAF V600E突变型308例（42.3%）。TERT C228T突变型78例（10.7%），TERT C250T突变型4例（0.5%），两种突变相互排斥，不共存。TERT启动子突变82例（11.2%），其中59例合并BRAF V600E突变。BRAF V600E突变组中，TERT启动子突变率为19.2%；在BRAF V600E 野生型中，TERT启动子突变率为5.5%（P＜0.001，图1）。

图1 BRAF V600E及TERT启动子突变占比

2.2 TERT启动子突变和BRAF V600E突变与PTC患者临床病理因素之间的关系

如表1所示，TERT启动子突变与患者发病年龄（P=0.034）、腺外侵犯（P=0.026）、肿瘤直径（P=0.028）、中央区淋巴结转移（P=0.012）、远处转移（P=0.001）、TNM分期（P＜0.001）、病理亚型（P=0.003）以及肿瘤复发（P=0.002）显著相关。而与患者性别、多灶性、伴桥本甲状腺炎、侧颈淋巴结转移之间的关系差异无统计学意义（P＞0.05）。

BRAF V600E突变与PTC患者的腺外侵犯（P=0.001）、肿瘤直径（P＜0.001）、桥本甲状腺炎（P＜0.001）、远处转移（P=0.010）、TNM分期（P=0.009）和肿瘤复发（P=0.001）显著相关。与患者年龄、性别、多灶性、中央区及侧颈淋巴结转移、病理亚型间的关系差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

2.3 仅TERT启动子突变、仅BRAF V600E突变和TERT与BRAF V600E突变共存与PTC患者临床病理因素之间的关系

与无TERT启动子突变且无BRAF V600E突变组相比，仅携带TERT启动子突变与腺外侵犯（P=0.008）、肿瘤远处转移（P=0.003）、更高的TNM分期（P＜0.001）及肿瘤复发（P=0.005）显著相关。与无突变组相比，仅携带BRAF V600E突变与腺外侵犯（P＜0.001）、多灶性（P=0.041）、合并桥本甲状腺炎（P＜0.001）、远处转移（P=0.003）、更高分期（P=0.011）及肿瘤复发（P＜0.001）显著相关。同时伴有BRAF V600E和TERT启动子突变与发病年龄（P=0.024）、腺外侵犯（P=0.022）、合并桥本甲状腺炎（P=0.005）、中央区淋巴结转移（P=0.018）及更高临床分期（P=0.002）显著相关（表3）。

表1 TERT启动子突变与临床病理因素之间的关系例（%）

表2 BRAF V600E突变与临床病理因素之间的关系例（%）

表3 仅TERT启动子突变、仅BRAF V600E突变和TERT与BRAF V600E突变共存与PTC患者临床病理因素之间的关系例（%）

表3 仅TERT启动子突变、仅BRAF V600E突变和TERT与BRAF V600E突变共存与PTC患者临床病理因素之间的关系例（%）（续表3）

3 讨论

本研究为目前国内对PTC 中TERT启动子突变较大样本量的研究，证实TERT启动子突变对高侵袭性PTC 肿瘤的发生发展具有重要作用。目前国内外研究报道PTC患者中TERT启动子突变率约7.3%～25.5%[5，7-10]，本研究中TERT启动子突变率为11.2%，较文献报道较低，可能因为TERT启动子突变更常发生在肿瘤晚期，而本研究中临床分期Ⅲ、Ⅳ期的患者仅占9.2%，但其突变率高达49.3%，说明TERT启动子突变对中晚期甲状腺癌具有深远的影响。本研究发现在PTC 不同的病理亚型中，高柱状细胞亚型TERT启动子突变率最高（33.3%）。高柱状亚型是一种相对罕见，但恶性程度较经典型和滤泡亚型均更高的病理亚型，表明TERT基因在高侵袭的病理亚型中可能扮演重要的角色，也再次说明TERT启动子突变对PTC 的进展与侵袭发挥重要的作用。目前BRAF V600E突变对高侵袭性甲状腺癌临床病理因素的关系尚存争议[11-12]，本研究证实BRAF V600E 与PTC高侵袭性的特征显著相关，为之前的研究提供了有力的支持。

有多项报道PTC中BRAF V600E突变与TERT启动子突变之间的关联。有研究表明，BRAF V600E与TERT启动子突变存在协同作用，与PTC的不良预后密切相关[5，13]。然而也有研究认为BRAF V600E和TERT启动子突变无明显关联。但这些研究的样本量较少，其中TERT与BRAF突变的病例更少，以至于缺乏统计学效力。因此，此争议的解决依赖于大样本的研究。本研究发现BRAF V600E和TERT启动子突变之间的存在显著关联。

BRAF V600E与TERT启动子突变的协同作用可在分子水平得到解释。TERT通过添加端粒维持染色体的长度，促进细胞增殖减少细胞凋亡，使细胞获得永生性[8，14]。TERT启动子C228T和C250T突变通过产生E-twenty-six（ETS）转录因子的结合位点促进TERT基因的表达[5-6]，一些ETS因子同时也是MAPK信号通路上的靶点。而BRAF V600E突变引起的MAPK信号通路异常激活在PTC发生发展中起到重要作用，因此TERT启动子突变可能与PTC发展中涉及MAPK信号传导的机制相关。TERT启动子突变产生ETS转录因子的结合位点，在被BRAF V600E促进MAPK信号传导激活后启动或增强表达[13，15]。TERT启动子和BRAF V600E突变之间的这种关联为TERT表达的扩增创造有利环境。本研究结果与上述假设一致，BRAF V600E突变组中TERT启动子突变率更高，反之亦然。

本研究中，仅发生TERT启动子突变和仅发生BRAF V600E突变的PTC 与肿瘤复发和远处转移显著相关，但同时伴有TERT和BRAF V600E突变与复发和转移的关系差异无统计学意义。分析其原因可能为本研究随访中位时间2年，随访时间较短，可能严重低估了TERT和BRAF 对患者复发的影响，需要更长时间的随访，对资料进行生存分析，以进一步证实TERT和BRAF基因对患者预后的影响。

本研究证实BRAF V600E和TERT启动子突变与高侵袭性的临床病理因素相关，BRAF V600E和TERT 存在协同作用，对于指导治疗和评估预后具有积极作用。