和厚朴酚通过miR-155靶向抑制Smad3及其抑制高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的机制研究

（.海南省三亚市人民医院肾内科，海南 三亚 57000；.海南省三亚市人民医院血液净化中心，海南 三亚 57000；.广州中医药大学附属第一医院药剂科，广东 广州 50400）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见并发症之一，末期通常会发展至慢性肾功能衰竭[1]。高血糖诱导肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）凋亡和缺失，是糖尿病肾病的主要原因[2]。和厚朴酚（honokiol）是从木兰属植物中分离的一种小分子多酚，具有抗血管生成、抗炎、抗肿瘤的特性，且没有明显的毒性[3]。研究[4]发现，和厚朴酚对炎症引起小鼠GMC的凋亡具有潜在的抑制作用[5]。研究[6]表明，微小RNA-155（micro RNA-155，miR-155）广泛参与机体的多种病理生理功能，特别在DN肾组织和高糖诱导的肾实质细胞中表达上调[7]。Smad家族蛋白是一类重要的信号传导蛋白，在人体多种组织中表达并参与细胞的功能调节，但研究发现其在肾损伤组织中表达异常[8-11]。但是在高糖诱导的GMC中，miR-155和Smad3的关系尚不清楚。因此，本研究以高糖诱导GMC产生的细胞凋亡为模型，探索和厚朴酚对高糖诱导GMC凋亡的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠肾小球系膜细胞系SV40-MES-13（American type culture collection，ATCC细胞库）；高糖DMEM培养基和胎牛血清（Gibco公司）、胰蛋白酶Trypsin（Gibco公司）；和厚朴酚（Sigma-Aldrich公司）；抗Smad3抗体和抗β-actin抗体（Abcam公司）；总RNA提取试剂盒、real-time PCR试剂盒、反转录试剂盒（美国Invitrogen公司）；流式法细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；显微镜、Real-time PCR仪（美国Bio-Rad公司）；BCA蛋白浓度检测试剂盒（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将SV40-MES-13细胞培养于含10%FBS、1%青-链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2、湿度95%的培养箱中培养，待细胞融合为一层时，显微镜观察细胞形态，用Trypsin消化传代。

实验分组具体如下：空白组：培养基中加入D-葡萄糖5 mmol·L-1；高糖组：培养基中加入D-葡萄糖30 mmol·L-1；高糖+和厚朴酚组：D-葡萄糖30 mmol·L-1+和厚朴酚40 μg·mL-1。

1.2.2 细胞转染 待SV40-MES-13细胞培养至对数生长期，以每孔约2×105个细胞接种于6孔板中，培养至细胞基本融合为一层时进行转染。按照Lipofectamine 2000试剂说明书进行操作，将miR-con、miR-155、anti-miR-con、anti-miR-155、WT-Smad3+miR-con、WT-Smad3+miR-155、MUTSmad3+miR-con和MUT-Smad3+miR-155等载体用无血清培养基稀释，取等体积脂质体和各组载体混合静置20 min，将混合液加入到培养好的细胞中，培养6 h，换完全培养基，转染48 h后，收集细胞。

1.2.3 Real-time PCR检测mRNA的表达 收集对数生长期的各组细胞，提取总RNA，然后反转录合成cDNA，反应程序为16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、82 ℃ 5 min；4 ℃放置10 min，合成的cDNA于- 80℃保存。取cDNA按照real-time PCR的说明书进行反应，反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，40个循环；72 ℃ 10 min。miR-155上游引物5’-TTAATGCTAATCGTGATAGG-3’，下游引物为试剂盒内通用引物；Smad3上游引物5’-GAGAGGTGTGCGGCTCTACT-3’，下游引物5’-CTGGTTGCAGTTGGGAGACT-3’；β-actin上游引物5’-CATTGCTGACAGGATGCAGA-3’，下游引物5’-CTGCTGGAAGGTGGACAGTGA-3’。运用Bio-Rad PCR系统进行数据分析，内参参照β-actin。

1.2.4 流式细胞术测定细胞凋亡率 经葡萄糖和/或和厚朴酚处理后，各组细胞以约2×104个/孔接种于6孔板中，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养72 h，弃培养液，胰酶消化，离心收集细胞，按照Annexin V/PI试剂盒说明书进行操作，重悬细胞，加入5 μL膜联蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）和5 μL碘化丙啶混匀，室温避光20 min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达 将培养48 h的各组细胞收集后加入RIPA裂解液，超声破碎，收集蛋白，BCA试剂盒测定总蛋白浓度。进行SDS-PAGE，转膜，封闭2 h，加入稀释的一抗（抗Smad3抗体和抗β-actin抗体），4 ℃孵育过夜，洗膜2次，加入稀释的二抗室温孵育2 h，以β-actin为内参，分析蛋白表达水平。

1.2.6 双荧光素酶报告系统实验 用Trypsin消化转染48 h后的细胞，将其接种于24孔板中，接种密度1×104个细胞/孔，继续培养至细胞融合度80% -90%，进行转染，构建Smad3的野生型（WT-Smad3）和突变型（MUT-Smad3）双荧光素酶报告载体，然后分别共转染miR-con或miR-155，48 h后收集细胞，用裂解液室温裂解20 min，收集上清，加入荧光素酶底物，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.3 统计学处理

数据分析采用SPSS21.0软件进行，结果以均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，以P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 和厚朴酚对高糖诱导的GMC中miR-155和Smad3表达的影响

qRT-PCR和Western blot结果显示，与空白组相比，高糖组GMC中miR-155表达量显著下降（P＜ 0.05），Smad3 mRNA和蛋白表达量显著上升（P＜ 0.05）；与高糖组相比，高糖组+和厚朴酚组的细胞中，miR-155表达量显著上升（P ＜ 0.05），Smad3 mRNA和蛋白表达量显著下降（P ＜ 0.05），见表1。结果表明高糖诱导的GMC中miR-155表达下调，Smad3表达上调，而和厚朴酚逆转了高糖对GMC中miR-155和Smad3表达的影响。

2.2 过表达miR-155抑制高糖诱导的GMC细胞凋亡

qRT-PCR和流式细胞术结果表明，与高糖+miR-con组相比，高糖+miR-155组的miR-155表达量显著上升（P ＜ 0.05），细胞凋亡率显著下降（P ＜ 0.05），见表2。结果表明过表达miR-155可抑制高糖诱导GMC的凋亡作用。

表1 和厚朴酚对高糖诱导GMC中miR-155和Smad3表达的影响. ±s，n = 3Tab 1 Effects of honokiol on the expression levels of miR-155 and Smad3 in mice glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

表1 和厚朴酚对高糖诱导GMC中miR-155和Smad3表达的影响. ±s，n = 3Tab 1 Effects of honokiol on the expression levels of miR-155 and Smad3 in mice glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

注：与空白组相比较，*P ＜ 0.05；与高糖组相比较，#P ＜ 0.05Note：compared with the blank group, *P ＜ 0.05； compared with the high glucose group, #P ＜ 0.05

组别 miR-155 Smad3 mRNA Smad3 蛋白空白组 1.76± 0.35 1.28±0.29 0.56±0.07高糖组 0.48±0.11* 4.86±0.81* 1.27±0.14*高糖+和厚朴酚组 1.94±0.49# 1.46±0.35# 0.62±0.08#F 15.222 42.440 45.155 P 0.005 0.000 0.000

表2 过表达miR-155对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的影响.±s，n = 3Tab 2 The effect of overexpression of miR-155 on the apoptosis of glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

表2 过表达miR-155对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的影响.±s，n = 3Tab 2 The effect of overexpression of miR-155 on the apoptosis of glomerular mesangial cells induced by high glucose. ±s，n = 3

注：与高糖+miR-con组比较，*P ＜ 0.0Note：compared with the high glucose + miR-con group, *P ＜ 0.05

组别 miR-155 凋亡率/%高糖组 0.46±0.07 32.27±2.59高糖+miR-con组 0.42±0.08 33.86±2.93高糖+ miR-155组 2.43±0.17* 17.72±1.45*F 295.619 40.936 P 0.000 0.000

2.3 miR-155靶向调控Smad3的表达

Targetscan软件预测结果显示，Smad3的3’UTR序列中含有与miR-155互补的核苷酸序列，见图1。双荧光素酶报告系统结果如表3所示，与miR-con组相比，miR-155组野生型WT-Smad3的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降（P ＜ 0.05），而突变型MUTSmad3的萤火虫荧光素酶相对活性没有明显变化，说明miR-155与Smad3具有相互作用。Western blot结果表明，与miR-con组相比，miR-155组的Smad3蛋白表达量显著下降（P ＜ 0.05）；与anti-miR-con组相比，anti-miR-155组的Smad3蛋白表达量显著上升（P＜ 0.05），见表4，说明miR-155靶向负调控Smad3的表达。

2.4 沉默Smad3抑制高糖诱导的GMC凋亡

qRT-PCR、Western blot和流式细胞术结果显示，与高糖+si-con组相比，高糖组+si-Smad3组的细胞中Smad3表达量显著下降（P ＜ 0.05），细胞凋亡率也显著下降（P ＜ 0.05），见表5。说明沉默Smad3可抑制高糖诱导的GMC凋亡。

图1 Targetscan对miR-155和Smad3 mRNA核苷酸序列的预测结果Fig 1 Targetscan's prediction of miR-155 and Smad3 mRNA nucleotide sequences

表3 双荧光素酶报告实验结果. ±s，n = 3Tab 3 Results of dual luciferase reporter assay. ±s，n = 3

表3 双荧光素酶报告实验结果. ±s，n = 3Tab 3 Results of dual luciferase reporter assay. ±s，n = 3

注：与miR-con组比较，*P ＜ 0.05Note： compared with the miR-con group, *P ＜ 0.05

组别 WT- Smad3 MUT- Smad3 miR-con 1.00±0.07 0.95±0.09 miR-155 0.39±0.07* 0.98±0.11 t 10.673 0.366 P 0.000 0.733

表4 miR-155靶向调控Smad3的表达. ±s，n = 3Tab 4 miR-155 targeting regulates the expression of Smad3.±s，n = 3

表4 miR-155靶向调控Smad3的表达. ±s，n = 3Tab 4 miR-155 targeting regulates the expression of Smad3.±s，n = 3

注：与miR-con组比较，*P ＜ 0.05；与anti-miR-con组比较，#P ＜ 0.05 Note：compared with the miR-con group, *P ＜ 0.05； compared with the anti-miR-con group, #P ＜ 0.05

组别 Smad3 miR-con 0.59±0.06 miR-155 0.18±0.05*anti-miR-con 0.54±0.05 anti-miR-155 1.35±0.11#F 140.232 P 0.000

2.5 和厚朴酚通过miR-155靶向抑制Smad3表达，抑制高糖诱导的GMC凋亡

qRT-PCR、Western blot和流式细胞术结果结果显示，与高糖组相比，高糖+和厚朴酚组的Smad3表达量显著下降（P ＜ 0.05），细胞凋亡率也显著下降（P ＜ 0.05）。采用siRNA敲低方法分别敲低miR-155和Smad，发现与高糖+和厚朴酚+anti-miR-con组相比，高糖+和厚朴酚+ anti-miR-155组的Smad3表达量显著上升（P ＜ 0.05），细胞凋亡率也显著上升（P＜ 0.05）；与高糖+和厚朴酚+ anti-miR-155+si-con组相比，高糖+和厚朴酚+ anti-miR-155+ si-Smad3组Smad3表达量显著下降（P ＜ 0.05），细胞凋亡率也显著下降（P ＜ 0.05），见表6。

表5 沉默Smad3抑制高糖诱导的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 5 Silencing Smad3 inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

表5 沉默Smad3抑制高糖诱导的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 5 Silencing Smad3 inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

注：与高糖+si-con组比较，*P ＜ 0.05Note：compared with the high glucose+si-con group, *P ＜ 0.05

组别 Smad3 mRNA Smad3 蛋白 凋亡率/%高糖组 4.66±0.57 1.16±0.13 31.38±2.74高糖+si-con组 4.54±0.61 1.22±0.14 32.48±2.35高糖+si-Smad3组 0.88±0.12* 0.47±0.07* 14.72±1.61*F 58.403 37.761 57.052 P 0.000 0.000 0.000

表6 和厚朴酚抑制高糖诱导的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 6 Honokiol inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

表6 和厚朴酚抑制高糖诱导的GMC凋亡. ±s，n = 3Tab 6 Honokiol inhibited apoptosis of GMC induced by high glucose. ±s，n = 3

注：与高糖组比较，*P ＜ 0.05；与高糖+和厚朴酚+anti-miR-con组比较，#P ＜ 0.05；与高糖+和厚朴酚+anti-miR-155+si-con组比较，&P ＜ 0.05Note: compared with the high glucose group, *P ＜ 0.05； compared with the high glucose+honokiol+anti-miR-con group, #P ＜ 0.05； compared with the high glucose+honokiol+anti-miR-155+si-con group, &P ＜ 0.05

组别 Smad3 mRNA Smad3 蛋白 凋亡率/%高糖组 4.73±0.62 1.23±0.11 32.02±2.43高糖+和厚朴酚组 1.51±0.41* 0.48±0.06*16.59±2.28*高糖+和厚朴酚+anti-miR-con组1.58±0.44 0.58±0.07 14.72±1.79高糖+和厚朴酚+anti-miR-155组3.95±0.57# 1.09±0.09#28.37±2.17#高糖+和厚朴酚+anti-miR-155+si-con组3.76±0.53 1.04±0.13 29.54±2.94高糖+和厚朴酚+ antimiR-155+ si-Smad3组1.78±0.48& 0.63±0.09&15.20±1.15&F 23.021 33.244 40.127 P 0.000 0.000 0.000

3 讨论

随着人们饮食结构和生活方式的改变，糖尿病发病率越来越高，严重危害患者生命健康[12-13]。糖尿病通常引发糖尿病肾病，高血糖会导致GMC脱落和凋亡，最终导致肾小球硬化，肾功能衰竭[14-15]。然而，当前其发病机制未完全阐明、治疗效果仍不满意。

既往研究表明，和厚朴酚能够通过抑制促炎因子，改善肾纤维化[16]。王叶萍等[17]研究证实，和厚朴酚能有效抑制内毒素诱导的人GMC炎性细胞因子的表达，减轻肾损伤。房云岗等[18]研究表明，和厚朴酚可能通过抑制氧化应激及减轻炎症反应，抑制由线粒体诱导的凋亡途径而缓解肾脏缺血再灌注损伤。本研究证实，和厚朴酚可以抑制高糖诱导的GMC凋亡，与之前和厚朴酚保护肾组织细胞的研究结果相似。

miR-155是miRNA家族中典型的多功能miRNA，与细胞增殖、凋亡等密切相关[19]。Beltrami等[20]研究发现，miR-155在糖尿病肾病患者的肾小球和远端、近端小管中表达异常。本研究结果表明，在高糖诱导的GMC中：miR-155表达下调，加入和厚朴酚后可促进miR-155的表达并减少GMC凋亡；下调miR-155则可逆转和厚朴酚对GMC凋亡的抑制作用，说明和厚朴酚通过促进高糖诱导的GMC中miR-155的表达抑制GMC凋亡。

Smad3是转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）的下游信号分子，参与细胞凋亡、增殖、干细胞分化、胚胎发育等多个生物过程[21]。研究表明，在高糖诱导的足细胞中，Smad3磷酸化水平升高，细胞凋亡水平升高，下调Smad3可抑制高糖诱导的足细胞凋亡[22]。本研究发现，Smad3在高糖诱导的GMC中表达上调；和厚朴酚可抑制Smad3的表达；沉默Smad3可抑制高糖诱导的GMC凋亡，说明和厚朴酚通过抑制Smad3抑制GMC凋亡，与上述结果类似。

Targetscan软件预测结果发现，Smad3的3’UTR序列中含有与miR-155互补的核苷酸序列，暗示两者之间可能存在结合位点或调控关系。双荧光素酶报告系统结果表明，miR-155靶向负调控Smad3的表达，抑制Smad3表达可逆转miR-155下调对GMC产生的影响。由此说明和厚朴酚通过miR-155靶向抑制Smad3表达，从而抑制高糖诱导的GMC凋亡，证实了在GMC中miR-155与Smad3之间具有调控关系。

本研究证实，在高糖诱导的GMC中，和厚朴酚通过促进miR-155表达，靶向抑制Smad3表达，进而抑制GMC凋亡、减轻高糖诱导的GMC损伤，为和厚朴酚治疗糖尿病肾病提供了理论和实验支持。