薄荷醇提高臭氧治疗大鼠角膜碱烧伤的实验研究

（.牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江 牡丹江 570；.哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 5000）

臭氧也称超氧，是一种超活性氧，氧化性强、水溶性高，常温下可以解离，具有供氧、杀菌等特点，目前应用于诸多医学领域，例如皮肤疾病或消毒、周围血管、脑梗死后遗症等[1-2]。研究[3-5]发现臭氧还可用于治疗眼部疾病，例如病毒性结膜炎和角膜疾病等眼部病变。研究[3]证实臭氧水溶液对兔眼烟曲霉菌性角膜溃疡具有很好的抗菌治疗效果，与氟康唑滴眼之间的比较，疗效相似，而且具有天然不耐药、成本低等优势。肖彩雯等[4]通过体外灭菌实验研究，进一步证实了臭氧生理盐水对真菌性角膜炎的治疗效果。

本课题组前期实验结果显示，臭氧可以抑制大鼠碱烧伤后的氧化应激反应并改善预后，但由于臭氧水的不稳定性，生物利用度不高，因此如何进一步提高臭氧生物利用度，稳定、加强其疗效，对于临床推广和使用都具有重要意义，因此，如何提高臭氧的生物利用度，增强治疗效果是本次研究需要解决的问题。

薄荷醇属于萜烯类物质，是唇形科植物薄荷和薄荷精油的主要有效成分。中医记载，薄荷具有“芳香开窍，引药上行”渗透促进剂的功能，被广泛用于中药外用制剂，与现代经皮促透剂具有相似的作用。由于薄荷醇具有清凉镇静的作用，此外还可以使细胞表面的通透性增强，促使药物进入细胞内，减少药物表面的滞留时间，因此薄荷醇作为促透剂辅助药物吸收已成为国内外研究的热点[6]。薄荷醇除了可以外用，亦可作为清凉剂加入眼部制剂，缓解眼部刺激、干涩、灼热等症状。Ahn等[7]研究显示，含有薄荷醇的人工泪液明显缓解干眼症、促进泪液的分泌，且作用温和。本研究的主要目的是证实薄荷醇是否可以作为促透剂提高臭氧治疗大鼠角膜碱烧伤的治疗效果，进而改良臭氧水眼部应用制剂。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备

SPF级健康雌性大鼠，体重250 ～ 300 g，由牡丹江医学院医药研究中心动物房供给。分为6组（n =6）：对照组（即正常组模型，不做任何处理，仅用于对照）、模型组、臭氧组（2 mg·L-1），0.08%薄荷醇臭氧滴眼液组、0.10%薄荷醇臭氧滴眼液组、0.12%薄荷醇臭氧滴眼液组。大鼠碱烧伤模型制备：以4 mg·kg-1的剂量使用10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，进行麻醉。剪切直径为3.0 mm的圆形滤纸，在1 mol·L-1NaOH 溶液中浸泡60秒，并用其他滤纸将多余液体吸干后，迅速将其附着于角膜表面中央45秒，随后快速使用生理盐水于结膜囊冲洗70秒。在角膜中央可以看到灰白色的灼烧区域，呈圆形，大小相同表示建模成功。治疗方案：碱烧伤模型组滴眼生理盐水，每次3滴，每日3次，连续7 d。将臭氧溶解到灭菌注射用水中，制备成3 mg·L-1的浓度用于滴眼治疗。 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.003 6 g，臭氧25.2 mL，蒸馏水加至5 mL），0.10%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.004 5 g，臭氧25.2 mL，蒸馏水加至5 mL，溶液呈无色透明状，无刺激性等异味），0.12%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.005 3 g，臭氧25.2 mL，蒸馏水加至5 mL），滴注方式同上。治疗第7天后，处死大鼠、取材一部分置于EP管中，并储存于- 80℃冰箱中备用（ELISA法测SOD/MDA），另一部分用于HE染色和透射电镜标本制作。

1.2 形态学观察

分别在碱烧伤后第1、3、7天对大鼠眼角膜进行观察。裂隙灯显微镜（SLM2型，重庆康华公司）观察角膜溶解（使用Pfister评分标准）[8]，角膜浑浊（Holland评分标准）[9]。计算角膜新生血管长度及面积，公式：S = C/12×3.141 6[r2（r - l）2]，C为角膜血管网所占的圆周数，l为新生血管的生长长度，r为角膜半径。

HE染色：取1 mm×2 mm角膜置10%中性甲醛中固定48 h，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色及照相（Olymspus CKX53，日本Olymspus公司）。

透射电镜：取1 mm×2 mm角膜置于2.5%电镜，用戊二醛溶液固定24 h，再经锇酸固定、脱水、置换、包埋、定位、LKB超薄切片，饱和醋酸铀和枸橼酸铅双染色，透镜扫描照相（日立HT7800，日本日立公司）。

1.3 统计方法

用SPSS11.0统计软件对SOD、MDA数据进行处理。数据资料使用均值±标准差的方式表示，采用单因素方差分析的方法，P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 薄荷醇臭氧滴眼液对大鼠角膜碱烧伤后角膜恢复的影响

大鼠角膜碱烧伤后不同时间角膜浑浊Holland评分详见表1，其中0分最低（模型组），4分最高（对照组），评分越高显示治疗效果越好，实验评分显示0.10%薄荷醇臭氧滴眼液组效果最好。大鼠角膜烧伤后不同时间角膜溶解面积情况详见表2，角膜烧伤后不同时间角膜血管新生面积情况详见表3。治疗7 d后，与所有模型组相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液组角膜溶解面积和角膜新生血管面积最低（P ＜ 0.05）。

2.2 薄荷醇臭氧滴眼液对大鼠角膜碱烧伤后氧化应激损伤的抑制效果

角膜碱烧伤后，模型组与对照组相比MDA含量明显增加，SOD活力明显降低（P ＜ 0.05）。经过薄荷醇臭氧滴眼液治疗后明显降低角膜的氧化应激反应。与模型组相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液剂量组明显降低角膜组织中MDA的表达（P ＜ 0.05），增加SOD的活性表达（P ＜ 0.05），详见表4。

表1 各组大鼠角膜碱烧伤后不同时间角膜浑浊Holland评分Tab 1 Holland score of corneal opacity at different time after alkali burn in each group

表2 角膜烧伤后不同时间角膜溶解面积. ±s，mm2Tab 2 Corneal dissolution area at different time after corneal burn. ±s, mm2

表2 角膜烧伤后不同时间角膜溶解面积. ±s，mm2Tab 2 Corneal dissolution area at different time after corneal burn. ±s, mm2

注：与模型组比较，#P ＜ 0.05Note: compared with model group, #P ＜ 0.05

组别 伤后1 d 伤后3 d 伤后7 d对照组 0 0 0模型组 4.56±0.29 4.13±0.20 3.44±0.37臭氧组 4.44±0.32 3.48±0.42 3.15±0.52 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液组4.42±0.17 3.12±0.66 2.79±0.31 0.10%薄荷醇臭氧滴眼液组4.34±0.21 3.01±0.43# 2.45±0.24#0.12%薄荷醇臭氧滴眼液组4.22±0.12 3.11±0.49 2.53±0.25#

表3 角膜烧伤后不同时间角膜血管新生面积.±s，mm2Tab 3 Corneal angiogenesis area at different time after corneal burn. ±s, mm2

表3 角膜烧伤后不同时间角膜血管新生面积.±s，mm2Tab 3 Corneal angiogenesis area at different time after corneal burn. ±s, mm2

注：与模型组比较，#P ＜ 0.05Note: compared with model group, #P ＜ 0.05

组别 伤后1 d 伤后3 d 伤后7 d对照组 0 0 0模型组 3.95±1.58 8.83±2.11 20.17±2.42臭氧组 3.66±0.74 8.59±1.45 18.05±2.32 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液组3.49±0.95 8.25±1.31 17.25±2.04 0.10%薄荷醇臭氧滴眼液组3.36±1.23 8.24±1.54 16.77±3.94#0.12%薄荷醇臭氧滴眼液组3.54±0.90 8.29±1.37 17.49±2.72

2.3 薄荷醇臭氧滴眼液对大鼠角膜碱烧伤后形态学的影响

表4 治疗7 d后眼角膜组织中MDA和SOD含量Tab 4 MDA and SOD content in corneal tissue after 7 days of the treatment

HE结果显示，在角膜烧伤后第7天，对照组大鼠角膜上皮细胞完整，基质胶原纤维排列整齐，未见水肿；模型组角膜上皮细胞与基质层结构疏松，基质胶原纤维排列紊乱，发生水肿；臭氧组角膜上皮细胞完整，基质胶原纤维排列紊乱，水肿程度较轻；0.08%薄荷醇臭氧滴眼液组角膜上皮细胞与基质层结构疏松，基质胶原纤维排列紊乱，发生水肿；0.10%薄荷醇臭氧滴眼液组角膜上皮细胞结构完整，基质胶原纤维排列趋于整齐，水肿程度较阳性对照组轻；0.12%薄荷醇臭氧滴眼液组角膜上皮细胞与基质层疏松，基质胶原纤维排列紊乱，水肿较模型组轻。

SEM角膜超微结构观察可见，对照组角膜组织层次分明，上皮细胞间存在半桥粒，线粒体完好，基质胶原纤维细胞排列整齐；模型组急性损伤后角膜上皮组织脱落，细胞肿胀明显，细胞核大，不规则，基质胶原纤维排列紊乱；0.08%薄荷醇臭氧滴眼液组角膜上皮层次不完整，基质胶原纤维排列紊乱，线粒体变性明显；0.10%薄荷醇臭氧滴眼液组角膜上皮细胞层次略完整，细胞略微肿胀，细胞间有半桥粒连接，内质网完好；0.12%薄荷醇臭氧滴眼液组角膜上皮层次不完整，细胞肿胀，基质胶原纤维排列紊乱，线粒体变性明显。

3 讨论

薄荷醇有很强的促渗透作用，是目前临床领域中应用最为广泛的一种萜类促透剂[10]。实验表明[11-12]薄荷醇可促透诸多药物种类，包括激素类、抗菌类药物、抗炎类药物，抗癌、抗肿瘤类药物、麻醉药物以及蛇床子素、丹参等中药[13]。此外，由于薄荷醇自身具有消炎、驱风、镇痛、止痒的外用功效，在临床上常用于清凉止痒、头疼及鼻、咽、喉炎症以及眼部制剂等。

薄荷醇的促透机制目前尚不明确，很多关于其机制的探讨集中在Ca2+的浓度、细胞通透性、清凉、镇静等方面[14]。研究[15]证实薄荷醇可能通过TRPM8通道发挥清凉、镇静作用，因此可以减轻大鼠角膜碱烧伤后的灼热效应对细胞造成的损伤。另外，角膜碱烧伤主要的致病原理是热灼伤和氧化应激反应，新生血管的形成是影响视力恢复的重要环节因素[16]。在本课题组前期的实验中，已证实臭氧水制剂可以有效改善大鼠角膜碱烧伤后角膜溶解面积、降低新生血管面积、减低浑浊度（原理：臭氧可以释放游离氧增加细胞氧供，促进细胞恢复；另外，臭氧可以诱导抗氧化应激反应，并且抑制细菌的繁殖[17]），但由于臭氧不稳定，常温常压下容易解离[18]，生物利用度差，为了改善提高臭氧进入细胞的有效浓度和速度，采用药物协同的方式，通过增加薄荷醇作为促透剂，打开细胞膜表面的离子通道，使臭氧尽快进入细胞内，发挥其功效，本实验结果显示碱烧伤后7 d，与臭氧组相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液组确实可以减轻角膜新生血管面积、降低角膜浑浊度（P ＜ 0.05），并减轻氧化应激反应。薄荷醇作为促透剂有其应用的实验基础。

本研究的不足之处：本研究只是初步探索了薄荷醇作为促透剂的可能行，至于是否真正可以应用于产品制剂中，需要进一步的实验证明。另外，与冰片[19-20]等其它促透剂相比是否有优势，也还需要进一步去证实。