辣木叶多糖的提取及抗氧化活性研究

初雅洁，龚加顺

（1.大理农林职业技术学院，云南大理671000；2.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201）

辣木（Moringa oleifera Lam.）是一种起源于印度北部的热带、亚热带多功能植物，常绿或半落叶，广泛分布在印度，古巴尼日利亚等地，具有营养丰富、适应性广、抗逆性强等特点，被誉为“奇迹之树”和“植物钻石”。由于辣木具有辛辣味，所以取名为“辣木”，辣木又称为“鼓槌树”，是因其树干像鼓槌而得名。在中国台湾被称为“21世纪人体保镖”[1]，辣木与西洋参、灵芝并称为世界植物三宝。早在数百年前就有食用辣木的记载。其因特殊的营养保健功效成为健康食品界的宠儿，营养价值与“人类营养微型宝库”的螺旋藻相当[2]。每100 g叶粉中的多种矿物质、维生素和人体必需氨基酸的含量比世界卫生组织推荐的每日摄入标准高[3]。其中辣木叶、茎富含的VC是柑桔的6倍，VA是胡萝卜的4倍，钙和蛋白质的含量分别是牛奶的4倍和2倍，Mcburney等[4]研究报道，辣木的钾含量是香蕉的10倍，铁是菠菜的4倍，锌、镁含量明显高于其他蔬菜、水果等。与大豆相比，辣木蛋白质含量为27%，总氨基酸含量为19.8%。氨基酸种类及含量均可与大豆相媲美[5]。闻向东等[6]研究表明每克印度辣木根样品中的VC含量高达 10.35 μg/mL，钾的含量高达 20.454 μg/g。已被广泛应用于医药领域，被联合国粮农组织指定为重要的粮食替代品用于解决欠发达地区的粮食短缺问题，向非洲和南美洲等国家推荐种植。2012年被中国绿色食品发展中心认定为“国家首推绿色食品”，同年被评为“国宴特供菜”。

多糖是一种天然活性成分，普遍存在于动植物、藻类与微生物的细胞中，多糖存在于植物的根、茎、叶、花、果及种子中。辣木作为一种功能性植物，有着广阔的开发前景。辣木多糖为辣木中重要有效成分之一，含量丰富，是一种类似普洱茶多糖和人参多糖的一种高分子化合物。目前，关于辣木多糖的研究主要集中在提取工艺和对辣木多糖含量测定方面，而对不同产地辣木多糖的体外抗氧化活性迄今报道极少。鉴于此，本研究以辣木叶为原料，从提取辣木多糖的方法入手找到最优的提取工艺，分析得出6个不同产地辣木多糖的体外抗氧化活性，为辣木多糖分离纯化及其结构测定的后续试验打下坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣木叶：普洱市思茅区、丽江华坪县、楚雄元谋县、大理宾川县、德宏芒市、西双版纳景洪市6个地方，样本均取自树龄大体相近的辣木，辣木叶经干燥过300目筛，辣木品种为PKM-1改良种多油辣木。蒽酮：BBI Life Sciences；抗坏血酸：上海申博化工有限公司；三氯化铁：天津市化学试剂三厂；铁氰化钾：中国成都化学试剂厂；DPPH：天津市风船化学试剂科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UN752型可见-紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；RE5210旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ALpHA2-4 LD型冷冻干燥器：上海空气干燥机有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 辣木叶多糖提取工艺参数优化

1.3.1.1 辣木叶多糖的提取

辣木粉→70%热水反复浸提3次→合并滤液→抽滤→减压浓缩→石油醚萃取3次→无水乙醇沉淀→静置过夜→离心分离→冷冻干燥→辣木粗多糖

1.3.1.2 单因素试验

经多次预试验，确定液料比、提取温度、提取时间作为影响多糖提取得率的3个因素。分别做单因素试验，通过试验确定对辣木叶多糖提取得率的影响。

1）液料比对辣木粗多糖得率的影响

准确称取辣木叶粉末2.00 g，固定提取温度60℃，提取时间1h，分别考察液料比 10 ∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30 ∶1、35 ∶1（mL/g），对辣木叶粗多糖得率的影响。

2）提取温度对辣木粗多糖得率的影响

准确称取辣木叶粉末2.00 g，固定液料比20∶1（mL/g），提取时间 1 h，分别考察提取温度 40、50、60、70、80、90℃对辣木叶粗多糖得率的影响。

3）提取时间对辣木粗多糖得率的影响

准确称取辣木叶粉末2.00 g，固定液料比20 ∶1（mL/g），提取温度 70℃，分别考察提取时间 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 对辣木叶粗多糖得率的影响。

1.3.1.3 正交试验

通过单因素试验，得到辣木叶粗多糖提取的单因素最佳提取条件。在此基础上，通过正交试验，采用三因素三水平正交试验对各因素做进一步优化。具体因素水平见表1。

表1 辣木叶多糖提取正交试验因素水平Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment design of Moringa polysaccharides extraction

1.3.1.4 辣木叶粗多糖的得率和提取率的计算

辣木叶粗多糖得率/%=粗多糖质量/辣木粉末质量×100

1.3.2 辣木叶多糖体外抗氧化活性研究

采用化学显色反应结合分光光度比色法，对样品的还原力、清除DPPH自由基、清除羟自由基等抗氧化指标进行测定，以明确各样品的抗氧化活性情况。以丽江、普洱、大理、德宏、版纳、楚雄辣木叶的粗多糖为研究对象，选取浓度分别为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的多糖溶液，在不同产地和浓度下比较其抗氧化活性。

1.3.2.1 还原力的测定

分别精确吸取1.0 mL不同浓度的样品溶液于离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液和1%铁氰化钾溶液各2.5mL，混匀后50℃水浴20 min。取出加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，于4 000 r/min离心机中离心10 min。取1.0 mL上清液于试管中，加入2.5 mL超纯水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液。用超纯水作参比，在700 nm处[7]测定混合溶液的吸光值，每个样做3次平行。样品吸光值越大表明还原能力越强。

1.3.2.2 DPPH自由基清除能力

吸取待测的不同浓度的样品溶液1.0 mL于10 mL离心管中，加入4.0 mL DPPH甲醇溶液，混匀。室温25℃下暗处放置10 min，在517 nm处[8-11]测定吸光值，每个样做3次平行，求平均值。计算方法如下：

1.3.2.3 总抗氧化能力

ABTS+工作液用甲醇稀释到吸光度为0.7±0.05（吸取1 mL ABTS+工作液加入40 mL乙醇调制），波长为734 nm[12]，加100 μL样品于试管中，再加入3.8 mL稀释后的ABTS+工作液，室温25℃下放置6 min后测定吸光度，每个样做3次平行。计算方法如下：

式中：A1为100 μL多糖样品溶液+3.8 mL稀释后的ABTS+工作液；A0为3.8 mL稀释后的ABTS+工作液。

1.3.2.4 羟自由基清除能力

依次在离心管中加入0.15 mol/L FeSO4和2 mmol/L水杨酸钠、不同浓度的样品溶液各1 mL，最后加入6 mmol/L H2O2启动反应，于37℃反应1 h后，用超纯水作参比，在510 nm处[13-14]测定吸光值，每个样做3次平行。吸光值越小，清除羟自由基效果越好。计算方法如下：

式中：A0为以超纯水代替样品溶液时测定的吸光值；A1为加清除剂时测定的吸光值；A2为样品本身的本底值。

2 结果与分析

2.1 辣木叶粗多糖的提取工艺优化

2.1.1 液料比对辣木叶粗多糖得率的影响

液料比对辣木叶多糖得率的影响如图1所示。

液料比低于20∶1（mL/g）时，辣木叶多糖得率随液料比的增大呈现递增的趋势较明显。但当液料比到20∶1（mL/g）以后，随着液料比的增大，辣木叶多糖得率增长并不明显。表明液料比在20∶1（mL/g）以前，提取溶剂不足，导致辣木叶多糖得率不高；而液料比达到20∶1（mL/g）时，提取溶剂已接近最高值，随着液料比的增大，对多糖得率影响不明显。从提取效率角度来看，提取溶剂过多会给后续的试验增大工作量，因此，辣木叶粗多糖最适提取液料比应控制在20∶1（mL/g）为宜，多糖得率为9.89%。

图1 液料比对辣木叶多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction liquid－solid ratio on the Moringa polysaccharide yield rate

2.1.2 提取温度对辣木叶粗多糖得率的影响

提取温度对辣木叶粗多糖得率的影响如图2所示。

图2 提取温度对辣木叶多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the Moringa polysaccharide yield rate

提取温度在70℃之前，随着温度的升高，辣木叶多糖得率随着温度的升高而增高的趋势较显著，继续升高温度对提高辣木叶粗多糖得率影响不大。这可能是因为在一定的温度范围内，温度升高，辣木叶细胞结构被破坏和分子热运动加快，有利于增强传质从而提高辣木叶粗多糖得率；而多糖可溶物在温度过高的情况下不稳定，其可能会发生破坏和分解，造成辣木粗多糖得率下降。因此，辣木叶粗多糖最适提取温度应控制在70℃为宜，多糖得率为10.61%。

2.1.3 提取时间对辣木叶粗多糖得率的影响

提取时间对辣木叶多糖得率的影响如图3所示。

在提取时间为1.5 h以前，辣木叶多糖得率随提取时间的延长明显增加，随后趋于平缓最后出现下降的趋势。这可能是因为提取一定时间后多糖在提取液中趋于饱和，辣木叶粗多糖得率趋于平衡；而随着时间的延长，在较高的温度下，多糖成分也可能被破坏，导致其得率降低。因此，辣木叶粗多糖最适提取时间应选择在1.5 h为宜，多糖得率为9.68%。

图3 提取时间对辣木叶多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the Moringa polysaccharide yield rate

2.1.4 正交试验结果

为了确定各因素对辣木叶粗多糖得率的影响大小，对提取温度、提取时间、液料比3个因素进行正交试验，以确定最佳的提取组合，正交试验的结果见表2。

通过表2的极差分析可知，影响辣木叶多糖提取得率的因素大小顺序为：B>A>C。根据直观分析得出辣木多糖提取的最佳工艺条件为：A2B2C2，即提取温度为 70 ℃，液料比 20∶1（mL/g），提取时间为 1.5 h。

2.1.5 正交试验结果验证

通过正交试验得出辣木叶多糖提取的最佳提取工艺条件为A2B2C2，做3次平行试验进行验证。得出在此工艺条件下多糖的得率为11.48%，所得结果高于正交试验组合中的最优组合。

表2 辣木叶多糖提取得率正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment for Moringa polysaccharide yield rate

2.2 辣木叶多糖抗氧化活性研究结果

2.2.1 还原力的测定

还原能力的大小可以用来证实抗氧化活性的强弱，不同产地和浓度的多糖还原力见图4。

图4 不同产地和浓度的多糖还原力Fig.4 Different regions and the concentration of polysaccharide reducing power

从图4中看出，辣木叶多糖相对于抗坏血酸具有一定的抗氧化活性，不同产地水溶性多糖样品的吸光值随着样品浓度的升高而增大，说明还原力随着浓度的上升而不断增强，综合比较得出普洱多糖在6个样品中抗氧化活性相对较强。

2.2.2 DPPH自由基清除

DPPH自由基是一种十分稳定的有机合成自由基，不同产地和浓度的多糖对DPPH自由基清除能力见图5。

由图5可知，试验中随着样品浓度的升高，DPPH醇溶液特有的紫色在相应波长处的吸光值不断下降，说明清除率随样品浓度的增加而增大，综合比较得出普洱市辣木叶多糖在6个样品中DPPH自由基清除能力相对较强，浓度为5.0 mg/mL时自由基清除率达到63.11%。

2.2.3 总抗氧化能力

不同产地和浓度的多糖对ABTS+自由基清除能力见图6。

图5 不同产地和浓度的多糖对DPPH自由基清除能力Fig.5 Different regions and the concentration of polysaccharide DPPH scavenging ability

图6 不同产地和浓度的多糖对ABTS+自由基清除能力Fig.6 Different regions and the concentration of polysaccharide to the ABTS+radical scavenging ability

从图6中可知，辣木多糖相对于VC具有一定的抗氧化活性，试验中随着样品的加入抑制了ABTS·络合物的生成，随着浓度的升高，绿色的ABTS·络合物在相应波长处的吸光值不断下降，说明自由基清除率随样品浓度的增加而增大，综合比较得出普洱多糖在6个样品中总抗氧化能力相对较强，浓度为5.0 mg/mL时ABTS+自由基清除率达到46.36%。

2.2.4 羟自由基清除能力

不同产地和浓度的多糖对羟自由基清除能力见图7。

图7 不同产地和浓度的多糖对羟自由基清除能力Fig.7 Different regions and the concentration of polysaccharide of hydroxyl radical scavenging ability

从图7中发现，辣木叶多糖相对于VC具有一定的抗氧化活性，并且对羟自由基清除率与浓度呈正相关，综合比较得出普洱多糖在6个样品中羟自由基清除能力相对较强，浓度为5.0 mg/mL时羟自由基清除率达到72.47%。

3 结论

采用水提醇沉法提取辣木叶多糖，分别考察了液料比、提取温度、提取时间对辣木叶多糖提取率的影响，在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的正交试验来优化辣木叶多糖的提取工艺技术。正交试验结果表明，辣木叶粗多糖的最佳提取工艺：液料比20∶1（mL/g），提取温度为 70 ℃，提取时间为 1.5 h，通过3次平行验证试验得出，在此工艺条件下多糖的得率为11.48%。同时辣木叶多糖具有一定的体外抗氧化活性，随着浓度的升高抗氧化能力逐渐增强，综合分析6个不同产地辣木叶多糖的还原力、DPPH自由基清除能力、总抗氧化能力、羟基自由基清除能力，以普洱市辣木叶多糖的体外抗氧化活性最佳，其它各产地辣木叶多糖叶也具有一定的抗氧化活性。为各地辣木种植和特色产品开发提供了一定的指导依据。