巨峰葡萄酒发酵过程中甲醇杂醇油变化规律研究

陈静，郝俊光，蔡秋杏，戴梓茹，李桂英，袁燕萍，徐新凤

（1.北部湾大学食品工程学院，广西钦州535000；2.钦州市特色果蔬发酵重点实验室，广西钦州535000；3.石河子质量与计量检测所，新疆石河子832000）

葡萄酒以新鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部发酵或部分发酵制成含有一定酒精度的发酵酒[1]。葡萄酒的营养成分很多，其中包含丰富的碳水化合物、维生素、氨基酸、果胶，以及苹果酸、酒石酸、柠檬酸等物质，还含有钾、钙、镁、磷、锌、硒等微量元素[2]。葡萄酒不但营养价值高，同时还具有极高的医疗保健价值。近年研究表明葡萄酒中花色苷具有降血脂、抗变异、延缓衰老、改善视觉等作用[3]。葡萄酒中的白藜芦醇具有降低胆固醇和甘油三脂、降低血脂、防治心血管疾病及癌症等作用[4]。因此，除了作为平常的饮用需求外，广大消费者购买葡萄酒更具有养生需求。

广西地区葡萄资源丰富，葡萄酒酿造产量不断增加。但由于原材料葡萄和加工工艺会对葡萄酒的质量有影响（如葡萄的品种、质量与种植环境等），因而存在一定的安全风险，尤其是在酿造过程易产生甲醇及杂醇油等安全危害因子[5]。

通过对广西本地产的巨峰葡萄在酿造过程中进行跟踪检测葡萄酒中甲醇、异戊醇、异丁醇含量的变化以及总酸、总糖、单宁、酒精度理化指标，从而研究葡萄酿造过程中不同果胶酶添加量及不同温度下对葡萄酒中甲醇、异戊醇、异丁醇及理化指标总酸、总糖、单宁、酒精度等的影响。从而为巨峰葡萄酒发酵过程甲醇和杂醇油的控制因素提供了一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巨峰葡萄：钦州本地超市；白砂糖：北部湾大学文科地超市；帝伯仕果胶酶（酶活力＞50 U/mg）：南宁东南恒华道生物科技有限公司；帝伯仕18度酵母：烟台良缘酒业有限公司；焦亚硫酸钾：烟台帝伯仕自酿机有限公司。

试剂甲醇（99．8%）、异丁醇（99．8%）、异戊醇（99．8%）、乙醇（99．8%）、叔戊醇（99．8%）：均为色谱纯，天津光复精细化工研究所；氢氧化钠（分析纯）：天津化学试剂有限公司；福林酚（生物技术级）：上海麦克林生化科技有限公司；酒石酸钾钠（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

安捷伦（Agilent）7890B配氢火焰检测器气相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；色谱柱（聚乙二醇石英毛细管柱，柱长 60 m，内径 0.25 mm，膜厚 0.25 μm）：上海碧真仪器有限公司；UV1800紫外分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

葡萄→预处理（清洗、晾干、除梗）→挤碎（加入不同含量的果胶酶）→接种酵母发酵→主发酵→后发酵→澄清→成品葡萄酒

1.3.2 样品处理

将样品分为A、B试验组，均将葡萄汁初始糖度调至 24 °Brix。

A组为果胶酶添加量使用研究：分别称巨峰葡萄2 kg，除梗破碎，加入到3 L发酵罐中。分别将浓度为150 mg/kg的焦亚硫酸钾、0.2 g/kg的酵母加入发酵罐中，搅拌均匀。再分别将浓度为0、100、150、200 mg/kg的果胶酶加到每个样品中，搅拌均匀，置于24℃恒温箱下进行10 d的主发酵，主发酵结束、过滤、静置于16℃恒温箱进行后发酵。

B组为发酵温度的研究：分别称取巨峰葡萄1kg，除梗破碎，加入到2 L发酵罐中。分别将浓度为150 mg/kg的焦亚硫酸钾、0.2 g/kg的酵母、150 mg/kg果胶酶加入发酵罐中，搅拌均匀，分别置于24、28、30℃、恒温箱下进行10 d的主发酵，主发酵结束、过滤、静置于16℃恒温箱进行后发酵。

1.3.3 理化指标的测定

酒精度：酒精度计法，蒸馏测定；总糖：直接滴定法：采用2.5 g/L的葡萄糖标准溶液滴定；总酸：直接滴定法：采用0.05 mol/L氢氧化钠滴定；以上方法均参照GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[6]。单宁：参照NY/T1600-2008《水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定分光光度法》[7]。

1.3.4 甲醇及主要杂醇油含量的测定

参照GB5009.266-2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》[8]，将发酵醪液过滤，量取50 mL滤液倒入500 mL圆底烧瓶中，并加入50 mL蒸馏水，并开启冷却水，加入几粒沸石，连接冷凝管，用50 mL容量瓶作为接收器（外加冰浴），并开启冷却水，缓慢加热蒸馏，收集蒸馏液50 mL，混匀；吸取10.0 mL蒸馏后的溶液于试管中，加入0.10 mL叔戊醇标准溶液，混匀，备用。

1.3.5 气相色谱条件

色谱柱：岛津气相色谱柱毛细管柱（60 m×0.25mm×0.25 μm）；进样口温度：250℃；程序升温：初温 40℃，保持1 min，以4.0℃/min升到130℃，以20℃/min升到200℃，保持5 min；载气流量：1.0 mL/min；进样量：1.0 μL；分流比：20.1[8]。

1.3.6 标准品的配制

标准样品溶液的配制：用电子天平准确称取各0.5 g（精确至0.001 g）甲醇、异丁醇、异戊醇至于100 mL的容量瓶，分别用40%的无水乙醇定容，混匀，配制浓度为5 000 mg/L。准确称取2.0 g（精确至0.001 g）叔戊醇，用40%的无水乙醇定容，混匀，备用。

从标准品溶液中分别吸取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL甲醇、异丁醇、异戊醇至25 mL的容量瓶，用40%的无水乙醇定容至刻度，依次配制成浓度梯度为100、200、400、800、1 000 mg/L 的混标溶液。分别吸取10.0 mL的混标溶液于5个试管中，加入0.1 mL的叔戊醇，混匀，备用[9]。

1.3.7 数据处理

数据的处理是通过制作的标准曲线及安捷伦的7890B的OpenLab工作站软件获得结果。各种试验的试验数据均经过3次重复试验获得，采用平均值表示；采用WPS 2019软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 果胶酶的添加量对葡萄酒发酵过程中理化指标的变化影响

2.1.1 果胶酶的添加量对葡萄酒发酵过程中总酸含量的变化影响

在巨峰葡萄发酵初期添加不同的果胶酶含量，依照GB/T15038-2006中总酸方法的检测结果见表1。

表1 巨峰葡萄发酵过程中总酸的含量变化Table 1 Changes of total acid content in Jufeng grape during fermentation g/L

从表1可以看出，添加不同量的果胶酶对葡萄酒中的总酸基本没有影响。在发酵过程中，总酸含量一直不断下降，发酵到第10天，总酸下降速率变慢，后期逐渐趋于稳定。在发酵过程中酸类物质不断地快速分解，导致总酸快速降低，到后期酸类物质分解速率缓慢，总酸下降速率变小并趋于稳定的趋势。

2.1.2 果胶酶的添加量对葡萄酒中发酵过程中总糖含量的变化影响

巨峰葡萄发酵中添加不同的果胶酶含量，按照总糖方法的检测结果见表2。

表2 巨峰葡萄发酵过程中总糖的含量变化影响Table 2 Effect of total sugar content on fermentation of Jufeng grape g/L

总糖减少主要经酵母菌代谢转化成能量和醇类物质，醇类物质产生的种类和数量直接影响葡萄酒的品质[10]。由表2可知，添加不同量的果胶酶，对葡萄酒中总糖的含量几乎没有影响。葡萄酒在发酵的前6 d，总糖的下降速度很快，说明该时期，酵母菌生长繁殖旺盛[11]，需要大量的营养物质，因此分解糖类，从而导致总糖量快速下降，发酵到第8天含糖量降到很低，随后总糖含量降低十分缓慢，并逐渐趋于稳定。这是因为后期营养物质变少，酒精抑制作用导致酵母菌大量死亡，发酵作用降低[12]，因此总糖含量下降趋势变慢，发酵到第20天，两种葡萄酒的总糖含量均小于2.0 g/L，符合国家干红葡萄酒总糖含量标准之内（≤4.0 g/L）[13]干型葡萄酒。

2.1.3 果胶酶的添加量对葡萄酒发酵过程中的酒精度的变化影响

巨峰葡萄发酵过程中添加不同的果胶酶含量，按照酒精度的检测方法的检测结果见表3。

表3 巨峰葡萄发酵过程中酒精度的变化影响Table 3 Effect of alcohol degree on fermentation of Jufeng grape %vol

由表3可以看出，添加不同量的果胶酶，葡萄酒中的酒精度基本没有影响。葡萄酒在发酵过程中酒精度均呈快速上升后逐渐趋于平稳。从表3知，第2天到第8天是发酵最激烈的时期，在这个阶段酒精度的产生和总糖下降的速度呈现出一定的一致性，随后酒精度逐渐趋于平稳。

2.1.4 果胶酶的添加量对葡萄酒发酵过程中单宁含量的变化影响

葡萄发酵过程中添加不同的果胶酶含量，按照单宁的检测方法的检测结果见表4。

表4 巨峰葡萄发酵过程中单宁含量的变化影响Table 4 Effect of tannin content on fermentation of Jufeng grape mg/L

葡萄酒酿制过程中添加果胶酶，有利于增强多酚物质的浸提，从而使单宁含量的增加[14]。由表4可知，添加果胶酶，对葡萄酒中单宁含量有明显的影响，并随着果胶酶添加量的增加而增加。在一定浓度果胶酶范围内，随着果胶酶浓度的增大，果胶酶对葡萄表皮果胶的分解作用增大，分解释放到果肉中，使果肉中单宁的含量不断提高[15]。因此，果胶酶浓度越大，对葡萄品质影响越大，而葡萄酒在发酵的过程中单宁的含量均呈快速上升再缓慢增加，最后逐渐降低的变化趋势，此结果与杨颖琼等[16]的研究山葡萄发酵过程中单宁含量变化趋势相似。

2.2 果胶酶的添加量对葡萄酒发酵过程中的甲醇及主要杂醇油含量的变化影响

2.2.1 果胶酶添加量与甲醇变化的关系

果胶酶的添加量对巨峰葡萄酒发酵过程中甲醇含量的变化影响图见图1。

从图1可知，4组添加了不同量果胶酶的巨峰葡萄酒在发酵过程中甲醇含量均从0开始快速增加，发酵到第14天含量达到峰值，随果胶酶添加量由0～200 mg/kg，甲醇含量依次为 165.23、243.98、252.35、272.54 mg/L，发酵终止时甲醇含量依次为145.28、224.74、232.82、242.45 mg/L，甲醇含量均在国家标准范围之内。与对照组相比（145.28 mg/L），甲醇依次增加了79.46、87.54、97.17 mg/L。

图1 果胶酶的添加量对巨峰葡萄酒发酵过程中甲醇含量的变化影响Fig.1 Effect of pectinase addition on methanol content in Jufeng wine during fermentation

巨峰葡萄酒中甲醇的含量随着果胶酶添加量的增加而增加，而随着发酵时间的推进甲醇含量均呈先上升后缓慢下降的趋势。由于葡萄酒在发酵过程中原料的果胶不断大量酶解，生成甲醇的含量不断增加，而随着果胶的大量分解代谢，甲醇生成的速率变低，导致甲醇含量下降。

2.2.2 果胶酶添加量与杂醇油变化的关系

果胶酶的添加量对巨峰葡萄酒发酵过程中杂醇油含量的变化影响见图2。

图2 果胶酶的添加量对巨峰葡萄酒发酵过程中杂醇油含量的变化影响Fig.2 Effect of pectinase addition on fusel oil content in Jufeng wine during fermentation

从图2可以看出，4组添加了不同量的果胶酶时的巨峰葡萄酒在发酵初期没有杂醇油的产生，到第2 d杂醇油含量从0开始逐渐增加，发酵到第8天含量达到峰值，随果胶酶添加量的增加，杂醇油含量依为224.09、259.47、245.65、238.02 mg/L，发酵终止时杂醇油含量依次下降到 188.34、241.05、223.88、214.18 mg/L，与对照组比较（188.34 mg/L），杂醇油含量依次增加了52.71、35.54、25.84 mg/L。

添加果胶酶对巨峰葡萄酒中杂醇油的含量有影响，杂醇油的含量不随着果胶酶添加量增加而增加，反而下降，但随着发酵的进行杂醇油含量呈上升后缓慢下降的趋势。由于杂醇油产生的机理与甲醇不同，杂醇油主要是伴随着酒精发酵过程产生的,主要由两条代谢途径产生降解代谢路径和合成代谢路径；杂醇油α氨基氮源充足时，酵母以氨基酸为基质进行降解代谢路径，从而产生杂醇油；当发酵液中可利用的α氨基氮源缺乏时，酵母以糖为基质进行合成代谢路径，从而产生杂醇油[17]。

2.3 不同发酵温度下葡萄酒发酵过程中甲醇及主要杂醇油含量的变化

2.3.1 温度对甲醇含量的影响

分别选取24、28、30℃进行主发酵，温度与甲醇的关系图见图3。

图3 温度对巨峰葡萄酒发酵过甲醇含量的变化影响Fig.3 Effect of temperature on methanol content in Jufeng wine during fermentation

从图3可以看出，3组不同发酵温度下巨峰葡萄酒中的甲醇含量均从0开始快速增加，发酵到第14天时，甲醇含量达到峰值，随温度的升高甲醇含量依次为 252.98、276.5、291.03 mg/L，发酵终止时甲醇含量依次减到232.82、254.5、267.5 mg/L，含量均在国家标准范围。与对照组相比（232.82 mg/L），甲醇含量依次增加了 21.68、34.68 mg/L。

温度对葡萄酒中甲醇含量有影响，甲醇含量随着温度的升高而逐渐增加，并随着发酵时间的推进甲醇含量均呈先上升后下降的变化规律。温度升高，甲醇含量逐渐增加，这是因为温度升高使甲酯酶活性增强[18-19]，在一定温度范围内果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等多种酶活性随着温度的升高而逐渐增大，从而使果胶物质彻底分解，致使甲醇生成量增多。

2.3.2 温度对杂醇油含量的影响

分别选取24、28、30℃进行主发酵，温度与杂醇油的关系图见图4。

图4 温度对巨峰葡萄酒发酵过程杂醇油含量的变化影响Fig.4 Effect of temperature on fusel oil content in Jufeng wine during fermentation

观察图4中3组不同温度下发酵的巨峰葡萄酒，前2 d无杂醇油产生，而随着发酵的进行在第8天杂醇油含量达到峰值，随着温度升高杂醇油含量依次为245.65、210.91、200.66 mg/L，发酵终止时杂醇油依次降到223.88、173.42、169.81mg/L，与对照相比（223.88mg/L），杂醇油含量依次降低了50.46、54.07 mg/L。

从图4可以看出，巨峰葡萄酒中杂醇油的含量并不随着温度的升高而增加，相反其含量甚至降低，这与曾朝珍等[20]研究结果相似,但随着发酵的进行杂醇油含量呈上升后缓慢下降的趋势。

3 结论

本研究主要针对巨峰葡萄酒发酵过程中甲醇杂醇油的变化规律，研究发酵温度和果胶酶添加量对巨峰葡萄酒发酵过程中甲醇及杂醇油含量的影响及一些理化指标的检测结果。试验研究表明：

1）果胶酶添加量对葡萄酒发酵过程中的总酸、总糖及酒精度等指标几乎没有影响，但对单宁影响较大，其含量并随着添加量的增加而增加。自酿葡萄酒在发酵过程中总酸、总糖含量随发酵时的推进间先快速下降后趋于平稳，而酒精度呈快速上升后趋于平稳，而单宁的含量随发酵时间均呈先快速上升后缓慢增加最后下降的趋势。

2）添加果胶酶酿造葡萄酒时，有害物质甲醇和杂醇油的含量均有所增加。甲醇增加量与果胶酶添加量成正比，与对照组相比，果胶酶添加到200 mg/kg时甲醇含量接近为对照组的2倍，但其含量均小于国家标准400 mg/L。而杂醇油增加量并未随果胶酶添加量的增加而增加，相反其含量降低，但与对照组相比，其含量明显有所增加。

3）葡萄酒在发酵过程中甲醇含量随着发酵温度的升高而逐渐增加，而杂醇油含量随温度升高而逐渐降低。所检测的巨峰葡萄酒的各项指标均符合相关国家标准，无安全隐患。