汽爆预处理提取西番莲果胶及其性质分析

梁泳伦，郑丽丽，杨旸，郑晓燕，校导，钟爽，艾斌凌，杨劲松，盛占武，*

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南海口570228；2.中国热带农业科学院海口实验站，海南海口570102；3.海口市香蕉生物学重点实验室，海南海口570102）

西番莲（Passiflora edulis Sims）原产于巴西，在全球范围内广泛分布于热带和亚热带地区[1]，国内主要集中在海南、广西、云南、贵州、福建和台湾等地[2]，近年来种植面积不断增加，产业发展势头迅猛。根据农业农村部农垦局数据：截至2018年，全国实有种植面积66.7万亩，产量59万吨，产值高达30亿元，其中以广西和福建为主要种植区域，产量产值占全国80%以上。2019年预计全国西番莲产量达到100万吨以上。西番莲果肉风味独特，果汁、果脯等加工产品的需求也不断增加[3]。在加工过程中，西番莲果皮占鲜果重量的50%以上，目前大多直接废弃，不仅造成资源浪费，而且也存在污染环境的风险[4]。西番莲果皮基本组成中水分为9.93%、灰分7.52%、蛋白4.05%、可溶性膳食纤维19.20%、不可溶性膳食纤维38.05%、碳水化合物占21.28%、脂肪不高于0.1%[5]。研究表明，西番莲果皮具有降血压，改善骨关节炎的症状和减轻哮喘等功能[6]，果皮中以果胶含量最为丰富，占西番莲果皮干重的15%～20%。因此，西番莲果胶的提取利用是解决果皮废弃物综合利用的有效途径。

果胶在食品中的应用主要作为胶凝剂，增稠剂和胶体稳定剂[7]。由于果胶的功能性质和应用，全球对它的需求以每年约4%～5%的速度增长。目前，商业果胶大多来源于柑桔皮和苹果渣，随着全球市场对果胶的需求不断增长，新型植物原料也备受关注，例如柚子皮[8]，可可豆壳[9]，南瓜[10]，石榴皮[11]和油菜籽[12]等，西番莲作为果胶来源也备受关注。酸提取法是一种传统的提取方法，提取工艺较成熟，但是酸提取法提取温度高，提取时间长，导致产品质量下降和耗能高，因此，开发新的提取方法是很有必要的。近年来报道了微波辅助提取、亚临界提取法和酶提取法等提取果胶，这些方法一定程度上提高了提取率和果胶质量，但是也存在一定的缺陷如设备成本高，工艺环境要求高等。此外，已报道的西番莲果皮果胶提取方法还有电场加热提取法[13]、磁性纳米生物催化剂技术[11]和联合工艺法提取果胶。近年来，蒸汽爆破预处理法引起来广泛的关注。前期已利用蒸汽爆破结合水代法成功建立了油茶籽油高效提取和蛋白改性的方法[14-15]。蒸汽爆破过程是在高温高压瞬时泄压致使物料的细胞壁破裂、半纤维素和木质素降解、胞内物质随着细胞的破裂而溶出，进而提高提取和预处理效率[16]，同时蒸汽爆破处理还具有环境污染少、效率高等优势[17]。因此，本研究将以西番莲果皮为研究对象，采用汽爆预处理结合传统果胶提取工艺，比较汽爆处理对果胶的理化特性，建立西番莲果皮果胶的高效提取方法，以期为西番莲果皮的综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西番莲（紫果）：市售；半乳糖醛酸、咔唑、无水乙醇、95%乙醇、酚酞、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氢氧化钠、Folin-Ciocalteu试剂：美国阿拉丁工业公司；浓硫酸、浓硝酸：国药集团化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

蒸汽爆破试验台（QBS-80）：河南省鹤壁正道生物能源有限公司；电热恒温水浴锅（DJ-S12）：上海精宏实验设备有限公司；高速多功能粉碎机（DMF-10A）：永康市铂欧五金制品有限公司；离心机（Heraeus Multifuge X3R）：德国Thermo Scientific公司；数显旋转蒸发仪（RV10）：德国IKA公司；节能型智能恒温槽（DC-2015）：宁波新芝生物科技股份有限公司；精密电子天平（AL-104）、pH计（S20K）：上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；数显水浴恒温振荡器（SHC-CA）：常州普天仪器制造公司；紫外可见分光光度计（Evolution 300）：美国Thermo Fisher公司；傅立叶变换红外光谱仪（TENSOR27）：德国BRUKER公司；高效液相色谱仪（e2695）：美国沃特世公司；扫描电子显微镜（HITACHI S-3000N）：日本日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1 果皮的处理

参照Canteri等[18]的方法对果皮进行处理，具体方法如下：把西番莲果切开并把果肉掏出，把剩下的果皮切成小块，然后将果皮放置于沸水中加热3 min，取出流水冷却，沥干水分并在电热鼓风干燥箱于45℃干燥至恒重。用于酸提的果皮用高速多功能粉碎机进行粉碎并且过40目筛，得到西番莲果皮粉，而用于汽爆预处理的果皮暂不进行粉碎处理，用密封袋分别收集果皮粉和干燥果皮。

1.3.2 果胶的酸提取

果胶的酸提取工艺参照de Oliveira等[19]方法略作修改。称取10 g西番莲果皮粉加入到500 mL锥形瓶中，再加入pH 2的HNO3溶液300 mL，在95℃的恒温水浴锅中提取60 min。处理后的样品真空抽滤，收集滤液，旋转蒸发（45℃），浓缩为原溶液体积的四分之一。然后加入3倍体积的95%乙醇溶液进行果胶沉淀，静置 24 h，离心（4 000 g，10 min），得到果胶沉淀，在 45 ℃下干燥至恒重得到西番莲果皮果胶。果胶提取率的计算公式如下：

式中：G1为果胶质量，g；G2为果皮粉质量，g。

1.3.3 果胶的汽爆提取

蒸汽爆破的预处理方法参照孙俊良等方法[20]略作修改，方法如下：将70 g经过1.3.1预处理的果皮装入蒸汽爆破反应装置中，然后关闭反应门，将材料放置在一个封闭的空间内。通入水蒸气，在设定的压力下（0、0.3、0.6、0.9、1.2 MPa） 维 持 60、90、120、150、180、210 s，然后瞬间释放压力。经过蒸汽爆破处理后的果皮放在45℃的烘箱中干燥至恒重，然后用高速多功能粉碎机进行粉碎并且过40目筛得到蒸汽爆破预处理的果皮粉。然后按照1.3.2方法进行提取。

1.3.4 酯化度（esterification degree，DE）测定

酯化度测定参照Bagherian等[21]，称取0.2 g果胶样品于250 mL锥形瓶，加入2 mL无水乙醇湿润，再加入20 mL超纯水，搅拌使果胶样品完全溶解，加入5滴酚酞指示液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至出现粉红色并30 s内不褪色为滴定终点，记录消耗的NaOH溶液的体积，记为V1。继续加入10 mL浓度为0.1 mol/L NaOH溶液，放入恒温振荡器，30℃下以180 r/min摇晃2 h，加入10 mL 0.1 mol/L HCl溶液。加入5滴酚酞指示液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至出现粉红且30 s内不褪色，记录消耗的NaOH溶液的体积，记为V2。果胶酯化度计算公式如下：

1.3.5 西番莲果皮提取残渣的扫描电镜观察

参照Rodsamran等[22]的方法，将提取残渣分散固定在圆形金属台上，并使用精细涂层离子溅射涂覆一层薄金，然后置于扫描电子显微镜在10 kV加速电压下，放大500倍和3 000倍（×3 k）观察不同提取残渣的组织形态。

1.3.6 果胶的红外光谱分析

果胶的红外光谱扫描参照Al-Amoudi等[23]，果胶的红外光谱用溴化钾压片法测定。将样品干燥至恒重，取少量果胶与溴化钾以1∶50质量比混合均匀后压片，用傅里叶红外光谱仪中400 cm-1～4 000 cm-1的红外区域进行扫描16次，扫描分辨率为4 cm-1。

1.3.7 果胶分子量的测定

参照Yuree等[8]方法略作修改。用超纯水充分溶解果胶制的0.3%果胶溶液过0.22 μm微滤膜。使用装有两条串联的水溶性GPC色谱柱（7.8×300 mm），连接到Waters 2414 RI检测器的高效液相色谱仪测定果胶样品的分子量。温度参数为40℃下，流动相（0.05%NaN3溶液）的流速为0.6 mL/min。根据分子量为960、1 460、7 130、1 200、43 500、19 600、401 000 Da 和 800 000 Da葡聚糖校准曲线测定果胶分子量。

1.3.8 多酚含量的测定

1.3.8.1 没食子酸标准曲线的制作

参照Maran等[24]方法分别吸取取浓度为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的 0.5 mL 没食子酸标准液并加入2.5 mL Folin-Ciocalteu试剂（10%）和2 mL碳酸钠溶液（7.5%），避光放置1 h后，在750 nm下测量混合物吸光度，制得标准曲线。

1.3.8.2 果胶多酚含量的测定

将0.5 mL的果胶溶液（1%）、2 mL的碳酸钠溶液（7.5%）和2.5 mL的Folin-Ciocalteu试剂（10%）加入到具塞试管中。避光放置1 h后，在750 nm处测量吸收。根据标准曲线计算果胶中多酚含量，单位为没食子酸当量（mg GAE/g果胶）。

1.3.9 果胶的DPPH自由基清除率测定

参照Dos Reis等[25]，将1 mL果胶溶液（浓度范围从0.1 mg/mL～4.0 mg/mL）添加到4 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L）中。然后将其避光放置30 min，在517 nm处测定吸光度（样品+无水乙醇作空白对照）。用相同浓度的抗坏血酸为对照。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

式中：A为添加果胶或者抗坏血酸后混合物的吸光度；A0为果胶浓度为0时的吸光度。

1.3.10 果胶的流变特性

果胶的流变特性参照Rodsamran等[22]方法，使用具有20 mm平行板的流变仪研究果胶流变学特性。将果胶溶于40℃的蒸馏水中，搅拌直至完全溶解制成浓度为1%、2%和3%的溶液将用于流变分析。然后在25℃下以0.1 s-1～100 s-1的剪切速率评估流动性能。对于振荡试验，在10 rad/s的恒定频率下，将剪切速率从0.01%逐渐增加到10%以执行振荡应变扫描，确定线性黏弹性区域。对于振荡频率试验，在25℃下以应变值为1%的条件下，角频率范围1 rad/s～100 rad/s下测定储能模量G'和G''的变化。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次，结果以平均值±标准差的形式。方差分析使用SPSS 23.0软件分析。

2 结果与分析

2.1 蒸汽爆破对果胶提取率的影响

采用蒸汽爆破预处理以提高果胶提取率，探索不同汽爆强度（汽爆压力和维压时间）对果胶提取率的影响，结果如图1所示。

图1 汽爆压力和维压时间对果胶提取率的影响Fig.1 Effect of steam pressure and residence time on extraction yield of pectin

如图1所示，在初始阶段随着汽爆强度的增加，西番莲果皮果胶的提取率有显著的提高，在汽爆压力为0.6MPa、维压120s时，获得最大果胶提取率，为（18.84±0.32）%，而用传统酸提法所得果胶提取率为（10.40±0.41）%，蒸汽爆破预处理果胶提取率上比酸提法提高了81.15%，并且在统计学上两者存在显著差异。此后，随着汽爆强度的增加，果胶的提取率显著降低，在1.2MPa、维压120 s时，果胶提取率降低为（7.59±0.60）%，比未经汽爆处理的提取率变得更低。这一结果与Wang等[26]研究汽爆强度对可溶性膳食纤维含量变化趋势相一致。因此，选择合适的汽爆强度能获得最高的果胶提取率，主要原因是蒸汽爆破处理使西番莲果皮紧密的纤维结构解聚，酸提液更容易渗透进果皮内部，增加了果胶与酸溶剂接触面积，最终使更多的果胶溶解在提取液中，进而提高果胶的提取率。然而，当汽爆强度过高时，果胶多糖降解为寡糖，在醇沉阶段不能析出，导致了果胶提取率的显著降低[27]。此外，与其他文章所报道的西番莲果皮果胶的提取方法相比，如电场法（6.20%）[13]、超声辅助提取法（12.67%）[19]、高压处理法（14.34%）[28]和酒石酸提取法（18.2%）[29]，汽爆预处理结合酸提在果胶提取率上表现为更高效。

2.2 汽爆处理对果胶酯化度的影响

表1结果显示了采用不同汽爆条件处理果皮对果胶DE值的影响。

表1 蒸汽爆破条件对果胶DE值的影响Table 1 Effect of steam explosion conditions on DE value of pectin

本次研究所得果胶DE值为66.26%～83.40%，均大于50%，属于高甲氧基果胶。如表1所示，随着汽爆压力的增加和维压时间的延长，果胶的DE值显著降低，此外，酸提法所得果胶DE值为（83.40±0.49）%，显著高于蒸汽爆破预处理酸提取所得果胶。研究表明，在高强度的汽爆处理下，果胶的DE值减少是由半乳糖醛酸链的去酯化引起的。值得注意的是，在0.6MPa的压力下维压120 s，虽然得到了最大的果胶提取率，但是，其DE值仅为（67.25±0.48）%，显著低于条件为0.6 MPa，60 s所得到的果胶DE值（71.80±0.75）%，而且两者之间提取率统计学上没有显著差异。果胶的DE值对果胶的凝胶条件和速度有很大的影响，对于高甲氧基果胶来说，DE值越高胶凝速度越快[30]。因此，综合考虑果胶的提取率和DE值后，选取汽爆压力为0.6 MPa、维压时间60 s所得果胶进行后续性能测试。

2.3 汽爆处理对果皮表观结构的影响

利用扫描电镜观察物料在汽爆预处理前后果皮结构的变化，结果如图2所示。

图2 果皮残渣的扫描电子显微镜图像Fig.2 Sanning electron microscopy images of peel residue

从图2a，图2b可以看出，酸提后果皮表面显示出了一定程度的皱褶。汽爆法提取的果皮残渣，除了有一定程度的皱褶外，表面还产生大量的小坑洞（图2c，图2d）。可见，汽爆预处理后果皮与提取液接触面积更大，有效的促进了果胶的溶出，进而提高了果胶提取率。这些坑洞的产生是由于蒸汽爆破处理导致植物细胞炸裂，细胞壁破裂成孔隙以及非纤维素成分的降解所致[31]，因此，汽爆预处理可以改变果皮表观结构，进而有利于大量果胶的溶出。

2.4 果胶的红外光谱分析

汽爆前后果胶结构变化如图3所示。

图3 果胶的傅里叶红外光谱图Fig.3 The Fourier transform infrared spectra of pectin

两种果胶均表现出典型的果胶傅里叶红外光谱图。在3 650 cm-1～3 200 cm-1处都有一个较大的吸收峰，由O-H的伸缩振动、半乳糖醛酸链间或链内的氢键引起[32]。2 926 cm-1处出现较弱的吸收峰，此外酸提法果胶在2853cm-1处出现弱峰，这都是-CH2中的C-H对称伸缩振动和反对称伸缩振动所致。1 746 cm-1附近的吸收峰为酯化的C=O振动产生，而未被酯化的C=O在1 620 cm-1振动产生吸收峰[26]。因此，通过计算1 746 cm-1处的峰面积除以1 746 cm-1和1 620 cm-1处的峰面积之和的比值可粗略估算果胶的DE值[33]。红外光谱分析得到蒸汽爆破提取工艺果胶的DE值较酸提法果胶低。该结果与表2所示的DE值分析一致。1 300 cm-1～1 000 cm-1之间的吸收峰是由于C-O伸缩振动引起的，1 010 cm-1～1 150 cm-1之间的3个吸收峰表明西番莲果皮果胶中含有吡喃糖[23]。

2.5 果胶的分子量和总酚含量

果胶的特性与其平均分子量密切相关，果胶的分子量、Mw/Mn和多酚含量测定结果见表2。

表2 果胶的分子量、Mw/Mn和多酚含量Table 2 Molecular weight，Mw/Mnand total phenol content of pectin

由表2可知，汽爆法提取的果胶平均分子量为0.95×105Da，远低于酸提法的 6.98×105Da，此外，Mw/Mn为果胶多糖的多分散性指数，从结果可以看出两种果胶具有相似且较低的多分散性，也再次证明两种方法提取的果胶分子量较为集中。可见，汽爆处理过程中果胶发生了一定程度的降解，导致其分子量降低。此外，Adetunji等[34]研究表明，具有低分子量和化学修饰结构的果胶可以增加饱腹感和表现出选择性的细胞毒性，具有抗结肠癌作用。此外，低分子量的果胶还具有降低胆固醇、降低胰岛素和减少对胃多肽抑制的作用。

果胶中总酚的含量也是果胶性能的重要参数之一，多酚含量的高低直接影响果胶的抗氧化活性。多酚含量采用Folin-Ciocalteu方法测定，结果如表2所示，汽爆法提取的果胶总酚含量为18.82±0.10（mg GAE/g pectin），酸提法果胶为8.58±0.47（mg GAE/g pectin），多酚含量增加了1.19倍。可见，汽爆预处理不仅提高了果胶的提取率，还增加了果胶中多酚的含量，这一结果与Noda等[17]结果一致，主要是汽爆预处理过程中植物细胞壁破裂，细胞内容物大量释放所致。

2.6 果胶的DPPH自由基清除活性

以果胶的DPPH自由基清除率代表其抗氧化活性。在该方法中，DPPH自由基清除活性取决于OD517的大小，当抗氧化剂去除DPPH自由基时，果胶溶液的颜色从紫色变为黄色表现为OD517变小。两种果胶的DPPH自由基清除率如图4所示。

图4 果胶的DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging activity of pectin

在果胶浓度0.1 mg/mL～4.0 mg/mL的范围内，DPPH自由基清除率随果胶浓度的增加而显著增加，汽爆法提取的果胶DPPH自由基清除率显著高于酸提法，此外，当果胶浓度为12.0 mg/mL时，汽爆果胶的DPPH自由基清除率可达85.95%（数据未给出）但会产生少量沉淀，因此高浓度的DPPH自由基清除率没有给出。这与果胶中多酚分析结果一致，进一步说明汽爆预处理增加了多酚含量[35]。因此，汽爆工艺可增加果胶的多酚含量和抗氧化活性。

2.7 果胶的流变特性

果胶在高黏度液体中的增稠作用可以通过多种方法测试，其中剪切流变学方法应用最为普遍[36]。在25℃下分别测试了3种浓度（1%、2%和3%）果胶的流动行为和黏弹性，结果如图5所示。

图5 果胶的流变特性Fig.5 Flow characteristics of pectin solution

1%浓度的汽爆果胶由于黏度较低，流动曲线无法连续测得；其余浓度都显示了非牛顿流体的剪切稀化行为（图5a，图5b），其原因是剪切速度加快使果胶的分子间力减弱所致。在不同浓度溶液的测试中，高浓度果胶溶液的黏度比低浓度高。相同浓度的两种果胶在剪切速度较高时，酸提法果胶黏度更大，这可能是酸提果胶的分子量高于汽爆果胶，果胶链相互作用或链的缠结作用更强，流动阻力更大所致。在低浓度果胶溶液中，随着溶剂流过多糖链段，摩擦损失导致其黏度增加。当果胶溶液浓度增加时，果胶链聚集为三维网络结构，使之需要更多的能量来破坏网络结构[37]。根据Zhang等[38]研究结果显示，大多数浓缩果胶溶液（质量浓度大于0.5%）通常会表现出这种行为。在高剪切速率下，所有溶液的行为均类似于牛顿流体，因为果胶分子被重新排列，方向与流动方向相同。

在25℃、1%的应变值下测定两种果胶溶液的振荡频率如图5c和图5d所示，所有果胶溶液的G'和G''随着角频率的增加而增加。酸提果胶溶液最初为G'>G''，机械响应呈凝胶状，随着角频率的增加，G''与G'相交最终G''>G'，而机械响应的表现类似于液体。汽爆果胶溶液浓度在1%和2%时与酸提果胶溶液的曲线相似，但当浓度增加到3%时，机械响应表现为凝胶状行为（G'＜G''）。对于两种工艺的果胶溶液，总体表现出随着角频率降低和浓度增加，机械响应更类似于凝胶。因此，汽爆果胶溶液黏弹性较酸提法好，其原因是汽爆果胶分子量和DE值更低所致。

3 结论

以西番莲果皮为高甲氧基果胶的提取原料，用蒸汽爆破预处理果皮并用初步探究其工艺条件对果胶提取率的影响，然后把汽爆工艺所得果胶与传统酸提醇沉法所得果胶进行结构和性质分析。通过试验，得到结果：在蒸汽压力为0.6 MPa，维压时间为120 s，果胶提取率为18.84%，远远高于酸提法的果胶提取率。因此，在合适的汽爆强度包括汽爆压力和维压时间，蒸汽爆破工艺能够大大提高果胶的提取率。此外，汽爆处理促进了果胶多糖的降解，从而降低了果胶的分子量。另外，结果表明，汽爆果胶的多酚含量和抗氧化性较高而且通过流变学分析得出汽爆工艺所得西番莲果皮果胶都具有潜在的应用价值。