新肝宝对鲶爱德华氏菌感染黄颡鱼的保护作用研究

喻运珍，余少梅，袁改玲，邓平，张立强， 罗杨志，胡少迪,丁桂珍，程颖红

(1.武汉市农业科学院，武汉 430207；2.武汉中博水产生物技术有限公司，武汉 430207；3.华中农业大学，武汉 430070)

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，鲶形目、鲿科、黄颡鱼属鱼类，在我国主要淡水水域中分布较广，具有比较高的经济价值，目前在我国已形成了较大的养殖规模[1]。但是随着集约化养殖程度的提高和养殖密度的不断增大，黄颡鱼病害逐渐增多，其中鲶爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)引起的“裂头病”或“红头病”危害最为严重，具有传染性强、发病率高、死亡率高等特点[2]。鲶爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)细菌，生产上主要通过抗生素药物来治疗[3]。但是抗生素药物在水产养殖上的长期大量使用会导致很多问题，抗药性、水产品药物残留、影响水体环境微生态平衡，抑制养殖动物免疫系统等[4]。而中草药具有无残留、毒副作用小、不易产生耐药性等优点，能够提高机体免疫力、促生长、抗菌、抗病毒，用中草药代替抗生素防治水产动物疾病是未来的发展方向[5]。新肝宝，通用名为肝胆利康散，由茵陈、大黄、郁金、连翘、柴胡等药材粉碎加工而成，具有清肝利胆作用，主治鱼类肝胆综合征[6]。本研究旨在考察新肝宝预防用药，能否提高黄颡鱼抗鲶爱德华氏菌能力，同时比较了不同粉碎粒度(200目和600目)对药效有何影响，为新肝宝在黄颡鱼鲶爱德华氏菌病防控中的应用提供相关数据参考。

1 材 料

1.1 材料和仪器 茵陈、大黄、郁金、连翘、柴胡、栀子、白芍、牡丹皮、藿香，均购自安徽旭松中药饮片有限公司，经武汉中博水产生物技术有限公司质检部门按照《中华人民共和国兽药典·2017年版中药卷》[6]鉴定合格。新肝宝由以上药材按比例粉碎混合而成，新肝宝200目由武汉中博水产生物技术有限公司生产，新肝宝600目委托山东埃尔派粉体科技股份有限公司生产。

脑心浸液培养基(BHI)购自青岛高科园海博生物技术有限公司，黄颡鱼商品饲料购自武汉大北农有限公司，溶菌酶、超氧化物歧化酶试剂盒购自南京建成研究所。

制料机购自九阳股份有限公司；生化培养箱，上海博讯实业有限公司；超净工作台，哈尔滨市冬联公司；小型台式离心机，德国Eppendorf公司；高压灭菌设备AMA240型，英国ASTELL公司；自动制冰机，日本三洋公司。

1.2 试验鱼 黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)购自湖北黄优源渔业发展有限公司。选取健康黄颡鱼280尾，体重25±5 g，暂养于华中农业大学水产学院健康安全养殖实验大棚，每天换水1/3，控制水温为26 ℃，暂养3天后驯食，每天上午11点和下午4点投喂一次基础日粮，驯食一周后停食24 h开始实验。

1.3 病原菌的培养 鲶爱德华氏菌由中国科学院长江水产研究所提供，将菌划线接种于BHI平板28 ℃培养48 h，挑取单菌落于BHI肉汤中，于28 ℃震荡培养箱中培养48 h，血小球计数板计数，调节菌的浓度备用。

1.4 试验饲料制备 试验设计基础料和试验料。将新肝宝200目和600目粉末分别按0.1g /(kg鱼)加入商品化基础饲料粉末中，混匀后加入制料机，以适当比例加水搅拌均匀，将制备的湿料放暗处风干，即得试验料。

2 方 法

2.1 试验设计 将280尾鱼随机分为4个组，分别为正常对照组、阴性对照组、新肝宝200目组、新肝宝600目组，每组两个平行，每个平行35尾鱼，每天换水1/3。正常对照组和阴性对照组投喂基础饲料，新肝宝组投喂试验料，饲料每天按鱼体重的2%进行投喂，上午11点和下午4点各投喂一次。

投喂7d后停食24 h进行人工感染，预试验确定鲶爱德华氏菌感染浓度为3×107CFU/mL(半致死浓度)。阴性对照组和新肝宝组每尾黄颡鱼从腹鳍基部进行腹腔注射100 μL菌液，正常对照组每尾腹腔注射100 μL生理盐水，观察各组黄颡鱼死亡情况并记录。分别在感染前和感染后5d取样，每组取鱼5尾，取血检测血清指标，解剖取肝、脾、肾做病理切片观察组织学变化。

2.2 酶学指标测定 从黄颡鱼尾静脉取血，37 ℃放置1 h，4 ℃过夜，3500 r/min离心10 min，吸取上清，-80 ℃冷冻备用，溶菌酶、超氧化物歧化酶采用南京建成试剂盒进行测定。

2.3 组织病理观察 分别取黄颡鱼小块肝脏、肾脏、脾脏组织，置于4%中性甲醛溶液中固定24 h。经洗涤、脱水、透明、渗透与包埋后，切成 5 μm 厚薄片，贴片后，用 HE 染色法进行染色，再经脱水和透明后用中性树胶封片，400倍显微镜下观察。

2.4 数据处理 采用SPSS20.0统计软件对所有实验数据进行处理分析，所有数值均以“X±SD”表示，组间比较使用独立样本t检验，差异具有显著性时P<0.05，差异具有高度显著性时P<0.01。

3 结果与分析

3.1 死亡率测定 如图1所示，正常对照组从47 h开始出现黄颡鱼死亡，5d共死鱼3尾，最终的死亡率为4.3%；阴性对照组和新肝宝200目组经鲶爱德华氏菌人工感染后5 h即开始出现死鱼现象，新肝宝600目组25 h开始出现死鱼，5 d阴性对照组总死亡率达54.29%，新肝宝200目和600目组总死亡率分别为48.57%和44.28%，小于阴性对照组。说明饲喂新肝宝能够增强黄颡鱼抗鲶爱德华氏菌的能力，降低死亡率，且600目作用效果好于200目。

图1 不同处理组鲶爱德华氏菌感染后黄颡鱼的死亡率Fig 1 Mortalities of yellow catfish infected with Edwardsiella ictaluri in different groups

3.2 血清中溶菌酶含量测定 由图2可知，人工感染鲶爱德华氏菌前，各组间溶菌酶活性无显著性差异(P>0.05)，感染后，各感染组溶菌酶活性均升高，新肝宝600目组溶菌酶活性>200目组>阴性对照组>正常对照组，组间差异显著(P<0.05)。说明饲喂新肝宝可以提高感染爱德华氏菌后黄颡鱼体内溶菌酶活性，其中600目作用效果优于200目。

注: 图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 Note: Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05).图2 不同处理组黄颡鱼血清溶菌酶活性变化情况Fig 2 The changes of LZM activities in serum of yellow catfish in different groups

3.3 血清中超氧化物歧化酶含量测定 由图3可知，人工感染鲶爱德华氏菌前，新肝宝组超氧化物歧化酶活性显著高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05)，感染后，新肝宝600目组超氧化物歧化酶活性>200目组>阴性对照组>正常对照组，组间差异显著(P<0.05)。说明饲喂新肝宝可以显著提高黄颡鱼血液中超氧化物歧化酶活性，其中600目作用效果优于200目。

注:图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05) Note: Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05)图3 不同处理组黄颡鱼血清超氧化物 歧化酶活性变化情况Fig 3 The changes of SOD activities in serum of yellow catfish in different groups

3.4 病理切片观察结果

3.4.1 肝脏组织 由图4可知，正常对照组(a)肝脏细胞结构清晰，沿肝索排列整齐。阴性对照组(b)黄颡鱼肝细胞界限模糊，肝索结构不清晰，有炎症细胞浸润，还可以看到很多红细胞，有充血或出血现象；新肝宝200目组(c)没有清晰的中央静脉，有少量炎性细胞，但肝细胞界限较清晰，肝索结构明显，呈放射状；新肝宝600目组(d)肝脏组织结构清晰，细胞排列均匀规则，成放射状围绕中央静脉排列。说明投喂新肝宝能够减轻鲶爱德华氏菌感染引起的肝脏损伤，其中600目作用效果优于200目。

3.4.2 肾脏组织 由图5可知，正常对照组(a)黄颡鱼肾脏组织结构清晰，肾小管上皮细胞未见脱落、肿胀。阴性对照组(b)肾脏组织中细胞界限模糊，肾小管上皮细胞有坏死、脱落现象，出现空泡化变性，有大量炎性细胞浸润。新肝宝组(c、d)肾小管和肾小体结构清晰，部分肾小管上皮细胞有坏死、脱落现象，有红细胞充血现象，其中200目组(c)有炎症细胞浸润。说明新肝宝能够减轻鲶爱德华氏菌感染引起的肾脏损伤，其中600目作用效果略好于200目。

图4 不同处理组黄颡鱼肝脏病理切片图(×400)Fig 4 Pathological sections of liver of yellow catfish in different groups (×400)

图5 不同处理组黄颡鱼肾脏病理切片图(×400)Fig 5 Pathological sections of kidney of yellow catfish in different groups (×400)

3.4.3 脾脏组织 由图6可知，正常对照组(a)黄颡鱼脾小叶结构清晰，脾脏红髓白髓分界清晰，白髓内淋巴细胞聚集，红髓内弥漫脾血窦，脾小梁形态完整。阴性对照组(b)黄颡鱼脾小叶结构不清晰，结构紊乱，有大量炎性细胞浸润。新肝宝组(c，d)红细胞数目增多，有充血和出血现象，其中600目组(d)脾小叶结构清晰，脾窦和脾索均可见。说明新肝宝能够减轻鲶爱德华氏菌造成的脾脏组织损伤，其中600目作用效果优于200目。

图6 不同处理组黄颡鱼脾脏病理切片图(×400)Fig 6 Pathological sections of spleen of yellow catfish in different groups (×400)

4 讨论与结论

杜宗君等[3]研究发现鲶爱德华氏菌感染黄颡鱼后，以肝、脾、肾的损伤出现最早、最严重，是其损伤主要的靶器官，感染鱼最终因多组织、器官结构破坏，引起鱼体多器官功能衰竭而死亡。研究中黄颡鱼人工感染鲶爱德华氏菌5 d后，感染组黄颡鱼肝脏、肾脏、脾脏均分别出现不同程度的病变，其中新肝宝组黄颡鱼损伤程度明显小于阴性对照组，表明新肝宝对鲶爱德华氏菌造成的黄颡鱼肝、脾、肾损伤有一定的保护作用。同时，溶菌酶是一种水解酶，存在于许多鱼类体表粘液、肠道粘液、血清及巨噬细胞中，具有抗菌抗病毒的功能，是鱼类非特异性免疫的重要组成部分[7]。超氧化物歧化酶能够清除机体自由基，保护机体细胞免受损伤，是一种重要的抗氧化酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用[8]。饲喂新肝宝的黄颡鱼血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶活性显著高于阴性对照组，说明新肝宝能够提高黄颡鱼非特异性免疫能力。

新肝宝各药材成分中，茵陈中杜薛花酸、阿魏巧等有抑菌作用；大黄中大黄素具有抑菌、抗炎作用；连翘对多种革兰氏阴性菌、阳性菌、结核杆菌、真菌等有抑制作用；藿香及其提取物对细菌、真菌、病毒等病原微生物，均具有明显的抑制、灭杀作用；同时茵陈、大黄、郁金、连翘、柴胡、栀子、白芍、牡丹皮均有抗氧化、保肝利胆的作用[9-17]。因此，在新肝宝各组成药物的在抗菌和保肝功效的共同作用下，可以减轻鲶爱德华氏菌对黄颡鱼机体造成的损伤。

研究表明，茵陈有效成分咖啡酸可增强机体的免疫防御体系；大黄素、大黄多糖对机体免疫系统有双向调节功能；连翘苷可调节免疫功能，并有一定抗应激能力；藿香中百秋李醇具有调节免疫功能的作用；牡丹皮中丹皮酚具有增强细胞和体液免疫的作用[9,10,11,12,17]。在这几种药物有效成分的共同作用下，起到调节黄颡鱼免疫力的作用。新肝宝中9种药材，相辅相成，共同发挥提高免疫力、抗菌、保肝的作用，因此，新肝宝能够提高黄颡鱼非特异性免疫力，增强黄颡鱼对鲶爱德华氏菌的抵抗能力，在一定程度上减轻鲶爱德华氏菌感染导致的肝、肾、脾损伤，故新肝宝可以在黄颡鱼鲶爱德华氏菌病流行期作为预防辅助用药。

此外，研究还发现新肝宝600目超微粉作用效果优于200目极细粉[18]。中草药中有效成分一般需经过浸润、溶胀、渗透、分散才能溶出，采用超微粉碎工艺，细胞破壁率达95%以上，消除细胞壁阻力，能够加快溶出速率和溶出量，与传统粉散剂比较，具有有效成分释放快、生物利用率高以及临床作用效果显著等特点[19-20]。因此，新肝宝临床应用优先选择600目超微粉。

综上所述，新肝宝可以在黄颡鱼鲶爱德华氏菌病流行期作为预防辅助用药，且优选先用超微粉。