一株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其致病性研究

陈玲，宋亚芬，张兵，蒋桃珍

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia)是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus, CAV)引起，其病原CAV属于圆环病毒科，基因组由单链、环状、共价封闭的负链DNA组成[1-2]。该病最早由Yuasa等[3]报道，主要特征是导致感染鸡出现再生障碍性贫血和伴有免疫抑制的胸腺萎缩和淋巴细胞流失，并伴随着病毒、细菌或真菌感染。自从鸡传染性贫血病毒在日本首次分离以来[4]，该病毒已在几乎所有拥有家禽产业的国家被分离出来。除了贫血和相关症状外，在商品鸡群中经常观察到无贫血但死亡率增加的亚临床CAV感染[5]。

自2014年以来，从我国黑龙江、吉林、辽宁、宁夏、江苏等地的鸡群中分离出CAV的报道增加，且毒株多从混合感染鸡病料中分离，这些研究报道表明我国部分地区商品鸡中CAV感染比例较高，且可能也是导致鸡群一些相关疫病发生的诱因。但是在相关研究人员的报道中，没有发现对近些年分离毒株致病性的研究数据[6-7]。为进一步了解近期国内CAV分离株的分子生物学特征和对鸡的致病力，本研究采用2016年从北京平谷某鸡场死亡鸡肝脏中分离的一株CAV对1日龄SPF鸡进行致病性研究，同时进行了全基因组测序和特征性氨基酸位点分析。

1 材料与方法

1.1 病料 北京平谷某鸡场死亡鸡肝脏。

1.2 SPF鸡胚和鸡 6日龄SPF鸡胚和1日龄SPF鸡，均购自北京勃林格殷格翰维通实验动物有限公司。

1.3 引物设计与合成 参照美国CVB《外源性鸡传染性贫血病毒检测和鉴定的PCR方法》[6]，设计一对CAV特异性引物CAV F/R；根据GenBank中CAV全基因组，设计两对引物CAV F1/R1和CAV F2/R2, 引物序列见表1，由中美泰和生物技术有限公司合成。

1.4 主要试剂 大肠杆菌JM109感受态细胞、病毒DNA提取试剂盒、DNA Marker、Ex Taq Mix购自Takara公司；pGEM-T载体购自Promega公司; 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Omega公司。

表1 PCR扩增的引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR amplication

1.5 病毒分离 将肝脏组织剪成小块后置于研钵中，倒入适量液氮，充分研磨，按1∶5的体积比加入含双抗(1000 U/mL)的生理盐水，-80 ℃反复冻融三次，8000 r/min离心10 min，取上清，经0.22 μm滤膜过滤除菌。取研磨液经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，0.2 mL/胚。37 ℃继续孵育14 d，无菌收获胚体放入匀浆杯中，加入适量生理盐水(25 mL/胚)，10000 r/min匀浆2 min，间隔1 min，再次以相同速度匀浆2 min，经64目铜网过滤，收获含毒滤液，标记为CAV E1。将收获滤液再次接种鸡胚，并连续进行5次传代(CAV E1-E5)，每个代次病毒分装后保存在-80 ℃。

1.6 病毒鉴定和特异性检测

1.6.1 PCR检测CAV病毒 参照Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0说明书，提取CAV E2-E4代病毒基因组。以CAV F/R为引物检测鸡传染性贫血病毒，反应体系：2×Ex Taq Mix 25 μL，CAV F/CAV R(10 μmol/L)各1 μL, 模板10 μL, ddH2O 13 μL；反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51.5 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增结果。

1.6.2 纯净性检测 取CAV E4病毒液经滴鼻、点眼接种20只3周龄SPF鸡，0.2 mL/只，同时肌肉注射，0.5 mL/只。21d后按上述方法和计量重复接种一次。试验期间进行临床观察，第一次接种后42 d采血，参照《中国兽药典》方法，进行相关病毒(表2)的抗体检测。

表2 相关病毒抗体检测方法Tab 2 Detection method of related viral antibody

1.7 致病性试验 将60只1日龄SPF鸡随机分为3组，每组20只。第1组和第2组为试验组，分别经胸部肌肉接种100和10000 EID50CAV E4病毒，第3组为空白对照组，接种等量的生理盐水。分别在接种当天、接种后7 d、14 d、24 d、28 d和35 d对试验鸡进行称重，并在接种后14 d时采血测定其红细胞压积。

1.8 病毒全基因组的扩增、克隆和测序 以CAV E4 DNA为模板，分别以CAV F1/R1和CAV F2/R2为引物进行PCR扩增，将PCR产物回收后，与pGEM-T载体连接，转化到JM109细胞，取100 μL涂布含有氨苄的LB琼脂，37 ℃过夜培养。利用菌落PCR的方法鉴定重组子，挑选3个阳性克隆送往中美泰和生物技术有限公司测序。

1.9 序列比对与分析 将CAV E4的全基因组序列和VP1、VP2、VP3序列分别与国内外已发表的CAV分离株(毒株信息见表3)进行比对和分析[4]。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定 CAV E2-E4代病毒均能扩增出特异性的419 bp条带(图1)。

2.2 纯净性检测 接种的所有鸡除产生CAV特异性抗体外，其他所检测病原抗体均为阴性，也无鸡痘临床症状，表明所分离的CAV毒株是纯净的，

表3 序列信息表Tab 3 sequence information list

无其他病毒性病原污染。因此将毒株命名为AV1550，真空冷冻干燥后保藏在中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)。

M: DNA Marker; 1-3：CAV E2、E3、E4 的CAV特异性片段 M: DNA Marker; 1-3：CAV specific fragment of E2、E3、E4图1 CAV E2、E3和E4 PCR检测Fig 1 Identification of CAV E2、E3、E4 by PCR

2.3 致病性试验

2.3.1 临床观察 攻毒后2 d，对照组1只鸡出现非特异性死亡。10000 EID50感染组在攻毒后8 d开始出现死亡，在观察期内死亡率为50%；100 EID50感染组在攻毒后13 d开始出现死亡，在观察期内死亡率为25%。接种鸡出现死亡的高峰期在13～20 d。结果见表4。

表4 1日龄SPF鸡接种后死亡结果Tab 4 Deaths of 1-day-old SPF chicken inoculation

2.3.2 攻毒后不同时间试验鸡体重变化 不同剂量接种后7 d，各组试验鸡平均体重无明显差异。10000 EID50感染组在接种后14～35 d间，平均体重与对照组相比，具有极显著性差异(P<0.01)；100 EID50感染组在接种后21 d～28 d，平均体重与对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)，接种后14 d和35 d平均体重也低于对照组，但差异不显著(P>0.05)。具体数据见表5。

表5 不同时间鸡体重结果(n=10)Tab 5 Weight of SPF chicken at different time(n=10)

不同的大写字母表示差异显著(P<0.05)，*表示差异极显著(P<0.01)

Different capital letters indicate significant differences(P<0.05)，*means the difference is very significant(P<0.01)

2.3.3 对SPF鸡的致贫血作用 攻毒后14 d采血测定红细胞数量和压积(表6)，10000 EID50感染组红细胞数量及红细胞压积与对照组相比具有极显著性差异 (P<0.01)；100 EID50感染组红细胞数量也低于对照组，但差异不显著，红细胞压积与对照组相比具有显著差异(P<0.05)。

表6 红细胞数量和红细胞压积结果(n=10)Tab 6Record of erythrocyte and packed cell volume(n=10)

不同的大写字母表示差异显著(P<0.05)，*表示差异极显著(P<0.01)

Different capital letters indicate significant differences(P<0.05)，* means the difference is very significant(P<0.01)

2.4 AV1550全基因组序列分析 AV1550 E4基因组全长为2298 bp，非编码区含有4个21 bp的直接重复序列(Direct Repeat, DR)，编码区有3个部分重叠的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)，分别编码VP2(651 bp)、VP3(366 bp)和VP1(1350 bp)。CAV参考株全基因组序列可分为A、B和C 3个群(图2)，AV1550株属于A群，基因同源性分析显示，AV1550株与中国分离株LN15170的亲缘关系最近，基因同源性为99.7%，与TR20株亲缘关系最远，同源性仅91.7%。

图2 AV1550毒株的全基因组进化树Fig 2 Phylogenic tree based on whole genome of AV1550 and reference strains

2.5 AV1550与其它CAV参考株VP1、VP2和VP3序列比较 将AV1550株与NCBI上其它CAV毒株的VP1、VP2和VP3核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析，VP1核苷酸序列与已发表的CAV毒株的同源性在94.0%～99.6%之间，同源性最高的毒株为LN15170，最低的为FAdV-N22株；VP2核苷酸同源性在98.9%～99.8%；VP3核苷酸同源性为98.9%～100%。VP1氨基酸与已发表的CAV毒株的同源性在96.7%～99.6%，同源性最高的毒株为LN15170，最低的为SH11株和SDLY08株；VP2氨基酸同源性在98.2%～99.5%；VP3氨基酸同源性为97.5%～99.2%。CAV毒株的VP2和VP3序列非常保守，基因差异主要在VP1编码区。

2.6 AV1550株特征性氨基酸位点分析 AV1550株在VP1的75、89、125、141和394位均为强毒株特征性氨基酸；在VP1的高变区(aa139-aa151)的139和144位氨基酸分别为K和E，推测该毒株有较高的复制和传播能力。AV1550株VP1上特征性氨基酸位点见表7。

表7 AV1550 VP1特征性氨基酸位点Tab 7 Characteristic amino acids on VP1 of AV1550

3 讨论与结论

自Yuasa等[9]发现鸡T淋巴细胞系(如MDCC-MSB1)和B淋巴细胞系(如LSCC-1104B1)可用于培养CAV以来，细胞培养已成为CAV分离和繁殖的优选方法[5]。但不同亚型的MSB1对CAV感染的敏感性不同，部分CAV毒株(如CIA-1)不能在MSB1上复制[11]；此外，MSB1细胞有时经连续传代后对CAV的敏感性降低，甚至仅传代8周后病毒就不能在其上增殖[12]。有些通过细胞培养或PCR检测为阴性的样品，接种1日龄易感鸡后可产生CAV感染临床症状，已有研究表明用1日龄易感鸡进行病毒分离的敏感性是细胞培养的100倍以上。本研究采用鸡胚卵黄囊接种的方法成功分离出一株CAV毒株，且增殖的病毒滴度较高，这为某些不能适应细胞培养的田间CAV毒株的分离提供参考。

AV1550毒株的基因组大小为2298 bp，与国内外其它35个毒株的核苷酸相似性在91.7%～99.7%之间，与国内分离的大多数毒株的同源性均较高，与辽宁分离株LN15170同源性最高(99.7%)。不同毒株VP1核苷酸同源性在94.0%～99.6%之间，VP2核苷酸同源性在98.9%～99.8%之间，VP3核苷酸同源性为98.9%～100%。总体而言，CAV全基因及VP1、VP2和VP3的序列分析，表明其基因组变异很小，且VP2和VP3高度保守，VP1作为唯一的结构蛋白且刺激宿主免疫应答反应，其氨基酸差异相对较大[5]，这与国内外学者的研究报道一致。

Yamaguchi等[13]报道VP1中394位的氨基酸可能是毒力的主要决定因素。如果该位点为谷氨酰胺(Q)，则该分离毒株可能具有较高的致病性，如果该位点为组氨酸(H)，则其致病性相对较低。林欢等[14]对CAV全基因组序列分析后发现，除日本毒株C369外，绝大部分毒株在394位氨基酸均为Q。早期研究报道[15]，75V、89T、125I、141Q和144Q氨基酸同时发生突变，毒力会明显减弱，不会引起贫血、骨髓和胸腺萎缩。本研究中，为进一步明确氨基酸序列与致病性之间的关系，对分离鉴定的AV1550毒株进行了测序和致病性试验，AV1550毒株394位的氨基酸为Q，仅在125L和144E发生基因突变，表明毒株可能具有较高的致病性，且毒力不会发生明显减弱。而1日龄鸡的致病性试验证实AV1550毒株低剂量和高剂量接种组都可以导致鸡发病死亡，且高剂量组(每只鸡接种10000 EID50)可引起50%的死亡率，明显高于一般毒株感染引起的死亡率(通常不超过30%)，试验鸡有明显的贫血症状，增重迟缓。初步研究试验结果也表明，毒株的致病性与VP1特定位点的氨基酸具有相关性。

Renshaw等[16]报道VP1蛋白跨13个氨基酸(139 -151)的高变区(HVR)中139和144位的氨基酸在病毒的生长和传播中起重要作用，如果VP1 Q-139和/或Q-144时，病毒的复制和传播效率就会有所下降。AV1550毒株在139和144位氨基酸分别为赖氨酸(K)和谷氨酸(E)，推测其在机体的复制和传播能力可能较强，但毒株的该生物学特性还需要进一步试验研究。