河南省南阳市某猪场一例猪流行性腹泻的实验室诊断

金喜新，王宏亮，刘凡，孟伟，贾广敏，吕婧玉，李杰如

(1.河南省动物卫生监督所，郑州 450008;2.河南省科学技术协会，郑州 450008)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病，临床上以呕吐、水样腹泻、脱水死亡和哺乳仔猪高致死率为主要特征[1]。各种年龄段的猪只均易感染。1978年，比利时首次分离鉴定出该病毒，命名为 CV777[2]。随后，匈牙利、德国、泰国、韩国、日本、中国、美国等国家都陆续报道了本病。PEDV造成的危害非常严重，2010-2011年，我国有100多万头猪死于 PEDV[3]，2013年美国暴发PED疫情，当年美国损失了700万头仔猪[4]。现在PED已经成为影响养猪产业的主要疫病之一。目前，在我国猪病毒性腹泻病例中，感染PEDV的病例最多且最为严重[5]，没有得到有效的控制，是威胁养猪业的重要疾病之一。猪流行性腹泻最主要的传染源是患病猪和带毒猪，体内的病毒会随着粪便、唾液等排泄物、分泌物大量排出从而污染环境以及生产用具，被污染的饮水以及饲料等被易感猪摄入到体内会引起机体发病[6-8]。PEDV经常与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪嵴病毒(PKV)等病毒混合感染[9-11]。PEDV为冠状病毒属的成员，为单股正链 RNA病毒，PEDV的基因组全部长度约为28 kb，主要的结构蛋白为S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。在PEDV基因遗传进化分析和多样性分析中，特别以S蛋白、N蛋白、M蛋白研究的最多，M基因具有较强的稳定性，所以M基因也常用来对PEDV进行鉴定[12-13]。河南省南阳市某规模化养猪场有能繁母猪500头，2019年1月，猪只开始发生腹泻病，发病母猪50头，哺乳仔猪约150头，且发病猪只集中在同一或者临近产房，哺乳仔猪致死率非常高，给猪场造成了严重的经济损失。为查明病因，现场检查后并采集样品进行实验室检验。

1 材料与方法

1.1 样品收集 无菌采集发病哺乳仔猪粪便、唾液以及心脏、脾脏、空肠等。

1.2 常规检查

1.2.1 流行病学 通过现场检查并询问场主以了解本次腹泻流行情况。

1.2.2 临床观察 按常规方法对仔猪和母猪临床症状进行观察，并记录其精神状态、饮食、体温变化、排泄情况等临床表现。

1.2.3 病理解剖观察 用75%酒精擦拭仔猪体表，在超净工作台中打开猪胸腔和腹腔，观察并拍照记录心、肝、脾、肺、肾、肠道组织、肠系膜淋巴结和其他一些器官组织的病理学和形态学变化。采集各器官部分组织至4%甲醛溶液中保存，以备后续研究。

1.2.4 组织病理学观察 首先将保存于4%甲醛中空肠组织、盲肠组织、结肠组织、十二指肠、回肠组织、直肠组织取出，切成1.0x1.0x0.2 cm组织块，置于包埋盒中，自来水清洗，然后依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、展片、贴片、烤片等，最后进行HE染色。染色后将组织切片置普通光学显微镜下观察。

1.3 RT-PCR检测

1.3.1 样品处理 在采集的粪便和唾液的棉拭子试管中加入适量DMEM混合后，转移到高压灭菌后的EP管中，然后经过离心处理，取其上清液分装到其他管中然后-40 ℃低温保存。肠道组织和器官组织要取其一小部分剪碎然后在加入液氮的研钵中反复研磨，研磨结束后加入适量DMEM混合制成匀浆，然后将组织匀浆转移到灭菌后的EP管中，经离心操作后取上清分装到其他EP管中并-40 ℃低温保存。

1.3.2 引物的设计与合成 参照美国国家生物技术信息中心(NCBI)中登录的 PEDV的M基因保守序列(基因序列号：KM048291.1)、TGEV的N基因保守序列(基因序列号：KX499468.1)、PDCoV的S基因保守序列(基因序列号：MK478383.1)、使用 Primer premier 6.0 软件设计出针对以上基因的特异性检测引物，引物由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成。引物相关信息见表1。

1.3.3 提取RNA与反转录合成cDNA 使用Trizol法提取RNA，按照普通提RNA的步骤进行操作，提取RNA时注意防止污染。提取的RNA可以直接用于反转录或者-40 ℃低温保存。反转录时按照购买的Vazyme 反转录试剂盒的使用说明书步骤进行反转录操作，我们使用体积为20μL的反应体系。我们最终得到cDNA产物，产物可以直接用于PCR反应也可以-40 ℃低温保存。

1.3.4 PCR扩增 把已经反转录好的cDNA进行PCR扩增,分三组进行目的片段的扩增，分别为PEDV、TGEV、PDCoV目的片段扩增。这三组RT-PCR 反应体系总体积都为25 μL，各组按照严格用量加入特定的酶、水和上下游引物，同时每组设两个对照，阴性对照都为2 μL灭菌水，阳性对照分别为已知的 PEDV的M基因、TGEV的N基因、PDCoV的S基因各cDNA 2 μL，充分保证了试验结果准确性。程序设定见表2。然后结果使用凝胶电泳检测，在凝胶成像系统处理下观察并判定结果。

表1 RT-PCR 扩增引物信息Tab 1 The information of primers used for RT-PCR amplification

表2 PCR扩增程序Tab 2 PCR Amplification Program Setting

2 结果分析

2.1 发病情况 河南南阳市某猪场母猪发病50头、仔猪发病150头，母猪发病无死亡现象，仔猪发病死亡135头，并且发病相对集中。经与猪场场主交谈，得知该猪场已经注射猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒三联疫苗。

2.2 临床观察结果 临床上出现母猪腹泻、精神沉郁、营养不良，猪舍内部脏乱、粪便横流，仔猪严重腹泻、呕吐、体温升高、发育不良、食欲下降、毛发凌乱且沾满粪便和呕吐液、消瘦、站立不稳、病死率高、发病较为集中。临床观察如图1。

A:严重腹泻导致肛门红肿 B:仔猪腹泻 A:Anal redness caused by severe diarrhea in piglets B:Piglet diarrhea图1 仔猪临床症状Fig 1 clinical symptoms of piglets

2.3 剖检结果 对仔猪进行剖检观察，发现胃内充满大量气体，导致胃胀气，且胃内有黄色粘稠物，肠道普遍出现胀气，肠道内出现黄色液体，空肠胀气尤为严重，肠壁变薄变透明，缺乏弹性，肠壁和肠系膜有出血情况(图2)。

2.4 组织病理观察结果 取剖检仔猪空肠、盲肠、回肠、结肠、十二指肠组织做病理切片，在显微镜下观察结果并与正常肠道切片镜检图对照(对照组来自河南省动物性食品重点实验室)，发现各肠道出现不同程度病变，空肠出现明显病变，表现为肠绒毛萎缩、脱落。回肠肠道细胞碱性粒子增多。切片观察及对照如图3。

A:空肠出现肠绒毛萎缩(100×)B:健康仔猪空肠对照(100×)C：回肠细胞碱性染色颗粒增多(200×)D：健康仔猪回肠对照(200×) A:Intestinal villi atrophy in the Jejunum(100×)B:Negtive control of A(100×) C：Increase of alkaline particles in colon(200×)D:Negtive control of C(200×)图3 肠道病理变化Fig 3 Intestinal pathological changes

2.5 RT-PCR鉴定结果 采集猪的粪便、唾液、空肠、脾脏、心脏样品，运用RT-PCR方法同时进行PEDV、PDCoV、TGEV三种病原检测，结果显示仅有脾脏和空肠PEDV检出阳性，而其他组织既没检出PEDV，也没有检出PDCoV和TGEV。结果如图4所示。

M:DL2000 DNA marker；N1:PDCoV阴性对照； 1:空肠组织；2:唾液；3:脾脏；4:粪液；5:心脏； P1:PDCoV阳性对照；N2:PEDV阴性对照； P2:PEDV阳性对照；N3:TGEV阴性对照；P3:TGEV阳性对照 M:DL2000 DNA marker；N1:PDCoVnegative control； 1: Jejunum tissue;2: saliva;3: spleen; 4:fecal liquid;5: heart；P1:PDCoVpositive control; N2:PEDVnegative control；P2:PEDVpositive control； N3:TGEVnegative control；P3:TGEVpositive control图4 猪RT-PCR检测结果Fig 4 pig RT-PCR sample test results

3 讨论与结论

有研究显示，自2010年以来，全球范围内爆发的大面积仔猪腹泻给养猪行业带来了巨大的经济损失，给养猪行业带来重创[14-16]，然而其发病机制至今尚未完全了解。许多研究表明，目前引起仔猪腹泻的病毒主要是PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV这四种[17-19]，而且猪流行性腹泻是引起大多数猪腹泻的主要疾病。赵胜杰等研究表明，PEDV在河南省内具有一定的流行性。

经过前期的流行病学调查，得知该猪场已经注射过PEDV的疫苗，但是，经过综合诊断，本次发病仍是由于PEDV感染造成的，这可能是PEDV已经发生了变异导致之前注射的传统CV777疫苗不能产生保护作用，推测本场本次感染PEDV毒株与经典疫苗毒株有差异，提示我们要针对新变异的毒株研制出新的疫苗。但是在当下，建议猪场制定综合治疗和特异性治疗措施，标本兼治，及时控制疾病，减少经济损失。

目前，感染PEDV、TGEV、PDCoV的猪在临床上所表现症状极为相似，都表现为呕吐、腹泻、食欲不振、精神萎靡等症状，临床症状很难将其区分开来。而且这几种病对肠道的感染造成的病变也极为相似，在组织病理学方面也很难将其区分。故只能采取的是其他更有效的诊断方法进行诊断，比如血清学方法、PCR等特异性实验室诊断方法。本次采用的是RT-PCR技术进行检测。该技术是比较快捷和方便的，也有相当高的准确性。通过RT-PCR技术方法我们最终确定本次猪场腹泻病是由于感染PEDV造成。

通过本次试验研究，建议PED预防免疫的主要工作是加大PEDV疫苗的研发力度，研制出新型的疫苗用来防控PEDV变异毒株的感染。