蛋白芯片法多肿瘤标志物检测在健康体检人群中肿瘤筛查的意义①

姜艳梅 王 晶 吴金明 张洪斌 林爱莲 王 楠

(大连医科大学附属第一医院检验科，大连 116011)

恶性肿瘤是一类严重威胁人类身体健康的常见病，早期发现、及时诊断是该病治疗及判断预后的关键，也是降低死亡率的最有效方法。肿瘤标志物(tumor marker，TM)是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合成分泌的或由机体对肿瘤反应而异常产生的/或升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、监测复发及预后评价具有一定价值。目前TM除前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)有相对较好的特异性外，其他均无严格的组织器官特异性，部分TM因受多因素影响在健康人群中也会异常表达，在恶性肿瘤的诊断和鉴别中受到一定限制。因此，建议多种TM联合检测，以达到提高恶性肿瘤诊断率的目的[1]。

蛋白芯片技术的发展为多TM联合检测提供了理想的工具，TM蛋白芯片分析技术是一门由生命科学和微电子学科相交叉的技术，通过该技术可以高灵敏、高通量及高特异性地进行蛋白质的微量分析[2]。本文将对比蛋白芯片多TM检测系统与电化学发光方法检测TM的结果，同时分析我院健康体检人群筛查结果，并对阳性个体追踪随访，探讨健康体检人群中蛋白芯片法多肿瘤标志物筛查对恶性肿瘤早期诊断的临床意义。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 2017年6月～2018年5月大连医科大学附属第一医院体检中心健康体检者7 339例，其中分别进行C6和C12A检测的体检者为5 944例和1 395例，年龄25～86岁，平均年龄为45.5岁。

1.1.2试剂和仪器 HD-2001A/LU-07型系列生物芯片检测仪和多肿瘤标志物蛋白芯片检测C6和C12A试剂盒购自上海铭源数康生物科技有限公司,C6的检测项目为癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、糖链抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)、细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment，CK19)和鳞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC)，C12A在C6的基础上又添加了神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、β人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin β subunit，β-HCG)、结合型前列腺特异性抗原(combined-Prostate specific antigen，c-PSA)、糖类抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3，CA15-3)、CA72-4和CA242；本实验通过本院伦理委员会批准，CobasE601电化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒购自罗氏；i2000化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒购自雅培公司(用于检测SCC)。

1.2方法

1.2.1比对实验 根据芯片检测范围，选取18例患者血清标本及2个水平罗氏质控血清分别应用多肿瘤标志物蛋白芯片检测仪及罗氏电化学发光分析仪进行检测，具体操作步骤参照仪器及试剂说明书，将所得结果进行比对分析。

1.2.2标本检测 空腹采集外周血3.5 ml离心分离血清，4℃冰箱保存且在4 d内检测完毕。对于检测结果异常者采用CobasE601电化学发光免疫分析仪(SCC采用雅培i2000化学发光免疫分析仪)进行单个项目TM检测复查，并与芯片法结果进行比对分析。对高度疑似病例随访调查，通过病理学和影像学等进一步检查以明确诊断。

1.2.3结果判断 两种方法检测12项肿瘤标志物正常参考区间，见表1。TM指标检测超过正常参考区间即诊断为阳性。以电化学发光法为标准，对蛋白芯片法进行方法学评价(真/假阳性、真/假阴性的判断)。对于经蛋白芯片法检测升高的标本，经电化学发光法复查后据此出具结果。

1.3统计学方法 采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，定性变量统计描述采用百分比和频数，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1芯片法与电化学发光法结果比对分析 根据CANS-CL02-A003文件，使用不同参考区间的检测系统间不宜进行结果比对。CEA、CA19-9、CA125、CK19、CA72-4、CA15-3采用定量结果比对分析，而AFP、NSE、 β-HCG则根据各自的参考区间判断是否为阳性，按定性结果比对分析。定量比对分析的结果如图1所示，两种检测方法相关性较好(P<0.001)，总体K值大于1，CEA线性最好，r2>0.95，CA125和CA15-3，r2<0.90，其余三项r2在0.90～0.95之间，具有很好的线性。定性比对分析的三个项目，采用配对资料的卡方检验，两种方法无显著性差异(P>0.05)，且不符合以化学发光法为准：AFP假阴性1例、假阳性1例，NSE假阳性1例，β-HCG 2例均为假阴性。

表1 蛋白芯片法和化学发光法检测TM的参考区间

图1 蛋白芯片法与电化学发光法方法学比较分析结果Fig.1 Comparative analysis of tumor markers detecded by protein chip and chemiluminescence

2.2蛋白芯片法检测健康体检人群TM结果 自2017年6月1日～2018年5月31日，共有7 339例健康体检者利用蛋白芯片法检测了多项TM，TM检出结果异常的标本601例，共637个项目，其中单项指标异常571例，组合指标(以两项指标同时异常为主)异常30例，有6例体检者以上3项均异常，总阳性率为8.18%，其中男性检出率为8.62%(383/4 442)，女性检出率为7.52%(218/2 897)。本团队对结果异常的体检者进行了6～18个月的跟踪随访，601例阳性标本中有13例经临床诊断为肿瘤病人，肿瘤检出率为0.2%，2例在体检前已经接受过肿瘤相关治疗；有81例存在良性甲状腺结节、肺结节、胆囊炎、胆囊结石、男性有前列腺增生或肥大等；169例由于生理变化及不良生活习惯引发TM升高，有28例3到12个月后异常项目恢复正常；其余均为不明原因TM异常，该组病人有待于继续追踪随访研究。

表2 健康体检者蛋白芯片法肿瘤标志物检测结果

表3 蛋白芯片法检出肿瘤标志物异常结果与应用化学发光法复检结果比较

表4 嗜异性抗体血清异常结果复查前后对比

601例健康体检标本中，各个检测项目的异常例数和检出率如表2所示，CA72-4、CEA、CA242的检出率较高，依次为7.12%、2.49%、2.44%；β-HCG、CA15-3、AFP检出率较低，依次为0.43%、0.36%、0.11%。除与性别有关的TM外，男女人群中，CEA、CA125、CA242检出率差别较大。

2.3蛋白芯片法检测异常结果与化学发光法结果比较分析 蛋白芯片法检测超出正常参考值范围的项目选用电化学发光法进行单个项目TM复查(SCC使用化学发光法进行复检)，根据年龄、升高程度以及是否为多项目异常等指标，共复查196 例，不包括污染和嗜异性抗体15例。在复查的196例标本中，两种方法结果一致，即真阳性者为151例(77.04%)，有47个项目的45例标本芯片法与化学发光法检测结果存在显著性差异，其中39例标本进行了SCC复查，只有9例结果一致，除去SCC后，真阳性率为90.44%。蛋白芯片法检出异常结果与化学发光法检测具体结果见表3。蛋白芯片法读取结果时根据是否显色均匀明亮判断患者是否存在嗜异性抗体，将怀疑标本应用化学发光法复检，结果如表4。

3 讨论

近年来，肿瘤的发生率逐年升高，在肿瘤发生发展过程中，早期症状隐匿，多数患者就诊时已发展为晚期，因此早期诊断对肿瘤的治疗和预后有十分重要的意义。目前，TM检测已成为继影像学和病理学诊断之后临床最常用的肿瘤诊断方法，在肿瘤普查、早期诊断、判断预后和转归以及评价疗效等方面具有较高的应用价值。与酶联免疫分析、放射免疫分析等传统的TM检测方法相比，蛋白芯片法以微阵列原理为基础，与化学发光免疫膜技术结合，应用计算机图像分析方法联合检测血清中的TM，具有样本用量少[3，4]、检测通量大等优点。随着人们对肿瘤的了解越来越多，高危人群对自己健康的关注日益增加，这种方便、多项目联合的检测方式越来越受到体检人群尤其是高危人群的欢迎。

蛋白芯片法检测TM利用抗原抗体特异性结合原理，采用双抗体夹心法，固相基质上包被的TM特异性单克隆抗体，捕获被检血清中对应的TM，然后结合第2代抗体(携带示踪标记物)，通过特定的化学反应产生光信号，用配套的生物芯片阅读仪读取光信号，以已知TM浓度做标准，对未知血清进行定量检测[5]。尽管蛋白芯片检测有诸多优点，但蛋白芯片法的应用也存在一些争议，有研究者表示其与单个血清TM检测比较存在一定的假阳性[6]。本研究收集了2017年6月～2018年5月期间到大连医科大学附属第一医院体检患者的数据进行分析。

本研究首先对蛋白芯片法和电化学发光法检测TM进行了方法学的比较分析，六项定量分析项目结果显示两种方法间有明显的相关性，r2分布在0.77～0.96之间，其中CA15-3因为高值偏离，造成r2值较低，其余都呈良好的线性，两种方法没有显著性差异；由于AFP、NSE、β-HCG芯片法与电化学发光法采用的参考区间不同，故采用定性的方法进行比较分析，结果显示两种方法无显著性差异，仅有个别标本存在差异，以电化学发光法为标准判断，AFP有1例假阳性，1例假阴性，AFP有1例假阴性，1例假阳性，β-HCG 2例则均为假阴性，与比对结果相同，在后续的工作中也遇到了AFP假阴性结果，因此在应用芯片法做健康人群肿瘤筛查时需注意结合临床，必要时应采取其他方法复检。

本研究根据患者的需求分别采用了6项或12项蛋白芯片分析了7 339例健康体检者血清中多项TM，结果显示7 339例样本应用蛋白芯片法检测共601例标本结果异常，总检出率为8.18%，男性高于女性，CA72-4检出率最高，AFP检出率最低，CEA和CA242在男性和女性群体中检出率存在较大差别，可能与男性吸烟、喝酒等不良生活习惯有关。本研究中总检出率高于国内的其他同类研究[6-8]，这些研究的检出率在2.2%-3.8%之间，但也有报道检出率和本文相近[9]。原因可能是由于在芯片C12A中包括CA72-4和SCC，而这两个项目检出率较高，其中有39例标本进行了SCC复查，只有9例结果一致，假阳性率较高，可能与操作过程中污染有关。SCC在人的唾液和皮肤中含量很高，而芯片法所需操作步骤较多，容易被污染，根据这个数据，扩大复查率的同时也要求检验人员在生物安全柜内操作，避免污染。

对于研究过程中的异常结果，本研究组应用了临床认可的方法进行了复查[6-7,10]。在检测体检者标本时，对蛋白芯片法检测结果异常的标本结合体检者其它情况，应用化学发光法对196例标本进行复查，除去SCC以外有9例为假阳性，与方法学比较结果相近，真阳性率为90.44%，假阳性的分别为CEA 6例、CA125 3例、CA19-9 5例，AFP、NSE、CA72-4分别1例，可能由于不同抗体反应需要的时间不同，而蛋白芯片法将多种抗体置于同一基质片上采用相同的反应时间，会影响检测的结果[10]。这一研究结果与其他国内研究结果基本一致，龚倩等[6]应用雅培I2000化学发光免疫分析仪对190例阳性标本进行复查，只有9例不符合前期结果，包括2例CA19-9、1例PSA、2例CEA、1例β-HCG；韩伟平等[7]应用CobasE411电化学发光免疫分析仪复查结果阳性233例，真阳性率95%。与其他国内研究相比，本研究的12项蛋白芯片采用的是C12A，将两项PSA整合为c-PSA，HCG变为β-HCG，增加了SCC，敏感性也有所提高。另外在实验过程中，有15例标本因显色异常判断为含有嗜异性抗体(人抗鼠抗体)，从而导致单项或多项结果异常[11]。应用蛋白芯片法测定TM时，检测试剂中与TM反应的是2种不同的鼠单克隆抗体，如果病人血清中存在嗜异性抗体，它可在2种抗体间起“桥梁”作用，导致在无抗原的情况下，抗体与抗体直接结合而呈阳性反应，进而造成TM浓度增高的假象。

另外，对复检后两种方法检测结果相符合的体检者进行跟踪随访，利用病理学、影像学等检测手段对于高度疑似病例做进一步确诊，其中有2例体检时已确诊癌症，13例体检后不同时间经临床确诊罹患肿瘤，肿瘤检出率为0.2%，其中有11例为多TM异常，因此多项TM联合检测对于健康体检人群恶性肿瘤筛查相对单项筛查更有意义[12-13]；有部分健康体检者是由于良性疾病引起的TM异常，以甲状腺结节居多，这与该疾病在大连地区多发有关；也有部分体检者几个月后复查恢复正常。半数体检者为TM不明原因的升高，该部分患者值得我们长时间的跟踪。

综上所述，蛋白芯片法检测多TM具有创伤小、成本低、灵敏度高等特点，一次最多可同时检测12种常见的TM，操作方法简单，提高了检测效率。与其他方法相比，这种联合检测系统更适宜于健康体和无症状人群筛查，尤其对高危人群的肿瘤普查具有很高的早期诊断价值。经过对7339名健康体检者的筛查，至文章撰写结束时，随访半年到一年时间，有13例新发病例，这些病例的诊断与TM的异常是分不开的。但同时也要注意，一些良性疾病、吸烟、饮酒、嗜异性抗体等均可影响检测结果[14]。鉴于有部分结果异常的体检者，经过复查后正常或异常原因不明，应用蛋白芯片法对于健康体检人群进行多TM检测时，更换结果异常者复检方法的同时，需联合CT、B 超、病理检查等手段进行综合判断，并且要定期复查、随访等，从而更好的达到早期发现、早期治疗的目的。