FTY-720通过S1P1受体调节哮喘小鼠气道炎症①

刘函晔 刘卫东 陈正爱 高 歌 延光海 张婧瑶 崔 弘

(延边大学基础医学院,延吉 133002)

近年哮喘的发病率和死亡率在全球范围内呈上升趋势，威胁世界3亿人口，主要特征为持续气道炎症和气道壁重塑体积为上皮细胞脱落、杯状细胞增生、气道平滑肌束增生和肥大、基底膜增厚和血管密度增加等病理变化。变应原反复刺激产生的炎症通过加重气道平滑肌病理变化加重哮喘，与慢性阻塞性肺疾病(COPD)相似，部分哮喘患者由于气道重塑、黏膜及平滑肌增厚引起气流受限导致死亡[1]。

鞘氨醇1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)通过5种G蛋白偶联受体S1P1-5参与细胞增殖、凋亡、淋巴细胞流出、内皮屏障功能、血管生成和炎症等细胞过程。研究表明S1P是肥大细胞的鞘脂代谢产物，诱导肥大细胞活化，肥大细胞激活后脱颗粒并释放生物活性物质，导致哮喘[2]。另外，S1P是淋巴细胞从次级淋巴器官进入体循环的主要调节剂，随着哮喘病程延长，血清S1P水平显著升高[3]。

FTY-720是治疗多发性硬化症的药物，是S1P受体激动剂，可与除S1PR2外的所有S1PRs结合[4]。FTY-720磷酸化后结构与S1P结构相似，与S1P竞争结合S1P1受体，阻断S1P1下游促炎通路，但S1P对哮喘的作用机制尚未明确。本研究以OVA诱导小鼠哮喘模型，探究FTY-720对S1P1的作用及其在哮喘小鼠中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与仪器 OVA、氢氧化铝混悬液(美国Sigma公司)，IL-4、IL-5、IgE(美国Invitrogen公司),全蛋白提取试剂盒、AB-PAS染色试剂盒(北京索莱宝公司)，S1P1、Wnt1、Phospho-RAC1-S71(美国Santa Cruz公司)，β-actin、P38-MAPK(美国Cell Signaling公司)，FTY-720(美国Cell Signaling公司)；402型超声雾化器(上海四菱医疗器械厂)，RT-2100C酶联免疫检测仪(美国Rayto公司)，电泳仪、Western blot转膜仪和Gel Doc凝胶成像仪(Bio Rad公司)。

1.1.2实验动物 30只雄性BALB/c小鼠随机分为3组:正常组、模型组、治疗组，每组10只，由延边大学医学部实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1哮喘模型建立 除正常组外，模型组和治疗组第0、7、14天腹腔注射0.05 g OVA和0.56 ml Al(OH)3溶于200 μl生理盐水。第21天起，将0.1 g OVA溶于10 ml生理盐水中激发30 min，共激发5天。第19天起连续给药7 d，第21天至第25天在激发前30 min腹腔注射FTY-720(2 mg/kg)200 μl。

1.2.2样本获取与处理 最后一次激发24 h后，乙醚麻醉小鼠并眼球取血，室温放置3 h后4℃1 500 r/min 离心15 min，取上清，-80℃储存待用。以生理盐水1 ml进行肺部灌洗，取支气管肺泡灌洗液(0.8 ml以上为合格)。取小鼠左肺于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片；右肺进行匀浆处理，并进行蛋白提取，-80℃储存待用。

1.2.3HE、AB-PAS染色 将组织石蜡块切成4 μm 切片，脱蜡处理进行常规HE染色；中性树胶封片后于光学显微镜下观察炎症细胞浸润及肺组织病理学变化。AB-PAS染色，观察肺组织气管周围杯状细胞含量变化。HE染色分析肺组织病理学变化。

1.2.4血清IgE含量检测 血清室温平衡2 h，ELISA检测版室温平衡30 min后每孔加入检测样本和标准试剂，加入检测试剂检测。加入TMB显色液，100 μl/孔避光30 min，加入终止液。酶标仪于562 nm处检测吸光度，绘制标准曲线，计算浓度。

1.2.5BALF中IL-1、IL-4、IL-5检测 眼球取血后处死小鼠，气管插管注入1 ml生理盐水，轻压小鼠胸部，回吸灌洗液(>80%为合格)，4℃ 1 500 r/min离心5 min，取上清，ELISA检测BALF中IL-1、IL-4、IL-5含量。

1.2.6肺组织中S1P1、Wnt1、p-RAC1、p-P38-MAPK含量检测 肺组织匀浆后提取蛋白并进行Western blot实验，对肺组织中S1P1、Wnt1、p-RAC1、p-P38-MAPK等蛋白进行半定量检测，以β-actin为内参。

2 结果

2.1FTY-720抑制OVA诱导的小鼠哮喘 与正常组相比，模型组小鼠气管周围有明显的炎症细胞浸润，气管壁明显变厚；FTY-720处理后，哮喘小鼠病理状况明显改善。AB-PAS染色后，模型组小鼠气管壁上有明显杯状细胞增生，FTY-720处理后杯状细胞数量显著减少。说明FTY-720抑制OVA诱导的小鼠哮喘的发生发展(图1)。

2.2FTY-720降低哮喘小鼠BALF中炎症细胞含量 模型组总细胞数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量明显升高，FTY-720处理后，小鼠BALF中OVA诱导增多的总细胞数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量显著降低(图2)。

图1 各组小鼠肺组织病理学染色结果(×200)Fig.1 Pathological staining results of lung tissue in each group of mice(×200)

图2 BALF中炎症细胞数量Fig.2 Numbers of inflammatory cells in BALF

图3 FTY-720对BALF中炎症因子水平及血清IgE含量的影响Fig.3 Effect of FTY-720 on inflammatory factors in BALF and IgE content in serum

图4 FTY-720对S1P1蛋白表达的影响Fig.4 Effect of FTY-720 on S1P1 protein expressions

图5 FTY-720对WNT1，RAC1，P38-MAPK蛋白表达的影响Fig.5 Effect of FTY-720 on expressions of WNT1,RAC1 and P38-MAPK proteins

2.3FTY-720降低BALF中炎症因子及血清IgE含量 与对照组相比，OVA诱导的哮喘小鼠BALF中IL-1、IL-4、IL-5含量明显升高，FTY-720处理后，细胞因子含量显著降低。OVA诱导提高小鼠血清IgE含量，FTY-720处理后IgE水平显著降低(图3)。

2.4FTY-720竞争性抑制S1P1表达 结果显示，给予FTY-720后S1P1表达降低，表明FTY-720竞争性拮抗S1P1受体表达(图4)。

2.5FTY-720抑制WNT1、RAC1、P38-MAPK的磷酸化 OVA诱导增加小鼠肺组织WNT1、RAC1、P38-MAPK磷酸化水平，FTY-720处理后WNT1、RAC1、P38-MAPK磷酸化水平显著降低(图5)。

3 讨论

哮喘由遗传因素与环境因素(如空气过敏原和呼吸道病毒)共同引起。在气道内腔内，过敏原可被树突状细胞捕获，处理抗原分子，并将其呈现为辅助T(Th0)细胞。过敏原特异性激活Th2细胞产生IL-4和IL-13，促进B细胞产生IgE抗体；释放IL-5诱导嗜酸性粒细胞成熟[5]。除Th2细胞外，IL-9释放的Th9细胞被激活后导致肥大细胞生长和募集，在IgE依赖性脱粒释放中发挥预形成作用和合成新介质。多种介质、细胞因子、转化生长因子等作用于慢性哮喘细胞，产生作用物影响包括上皮在内的气道结构细胞(成纤维细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞)的功能和增殖速度[6]。

Wnt家族由多种糖蛋白组成，具有高度保守的半胱氨酸残基。Wnt 信号途径在细胞间呈现自分泌和旁分泌两种信号传导方式，同S1P生物学功能相似，Wnt/β-catenin信号通路参与细胞增殖、形态发生和发育等多种生物学活动[7]。在肺部疾病中Wnt可激活TGF-β通路，引发肺纤维化[8]。研究表明WNT5A通过RAC和JNK通过不依赖于增殖的WNT信号诱导形成延长的淋巴网络，参与炎症反应[9]。RAC1在哮喘中起重要作用，敲低RAC1导致抗炎因子水平下降，影响上皮细胞的吞噬作用。P38-MAPK是MAPKs的亚群，与JNK通路相似，可被促炎因子如TNFα、IL-1等激活，或被脂多糖及G+细菌细胞壁成分激活。研究表明p38-MAPK参与哮喘炎症表达，可通过p38-MAPK/PI3K信号通路被抑制[10,11]。

尽管S1P与WNT等信号通路均有研究，但在哮喘中S1P与WNT的作用机制尚未明确。本研究通过给予FTY-720，发现S1P1受体表达可抑制哮喘炎症及改善病理状态；FTY-720处理后WNT、RAC1等蛋白含量明显减少，证明S1P可通过S1P1受体调控WNT通路，并通过抑制RAC1缓解哮喘。进一步检测MAPK通路中的P38-MAPK，P38-MAPK含量减少并可进一步激活NF-κB等通路，进一步抑制哮喘的炎症反应。

综上所述，FTY-720可抑制WNT通路，并通过抑制S1P1/WNT1/RAC1/P38-MAPK通路改善哮喘的炎症反应，改善肺组织病理变化。