绵羊红细胞溶血素制备方法的改进及其在教学实验中的应用①

孙元杰 国 航 唐 康 马 樱 张春梅

(空军军医大学基础医学院免疫学教研室,西安 710032)

在医学免疫学实验教学中，溶血素参与的溶血实验常作为补体系统中起到重要生物学功能的溶细胞的一个教学实验。国内有教学组用不同动物红细胞制备溶血素，并对溶血实验的效果进行了对比[1,2]。本教研室曾用全细胞加佐剂免疫小鼠的方法，用免疫组织化学方法筛选针对肿瘤相关抗原的抗体，发现全细胞加佐剂组筛选到阳性抗体的比率明显增加。据此，本文尝试用绵羊红细胞(sheep red blood cell，SRBC)加佐剂方法免疫家兔制备溶血素，发现其ELISA效价和溶血效价均明显高于常规SRBC经耳缘静脉免疫组，并在教学实验中取得满意效果。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要材料与试剂 酶标板购自康宁公司；酶标仪购自伯乐公司；四甲基联苯胺(TMB)显色剂购自碧云天生物公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司。

1.1.2实验动物 实验用动物均由空军军医大学实验动物中心提供。新西兰家兔4只,雌性,体重2～3 kg/只，随机分为A、B两组,每组2只。豚鼠心脏取血分离新鲜血清，将3只豚鼠血清混合作为补体来源。

1.2方法

1.2.1SRBC悬液制备 选用健康绵羊，颈静脉无菌取血，将羊血放入有玻璃珠的无菌三角烧瓶中，同一方向均匀用力摇动，充分混合，去除纤维蛋白,直至血液不会凝固。将抗凝血置离心管中，2 000 r/min，离心5 min，用生理盐水洗涤5次后,配成20%或10% SRBC悬液,置4℃冰箱保存备用。

1.2.2免疫方案 A组(常规耳缘静脉注射组) 首次剂量为每只家兔1 ml 20% SRBC悬液，第2～5次采用10% SRBC，每次间隔6 d，末次注射后第7天取免疫兔血，分离血清检测效价。B组首次剂量1 ml 20% SRBC悬液和1 ml完全弗氏佐剂混合，制备成“油包水”乳状液，2 ml/只家兔，腋下多点注射，第2～5次免疫用10% SRBC和不完全弗氏佐剂体积按1∶1混合制备成“油包水”乳状液，2 ml/(只·次)，注射次数和间隔时间同A组(见表1)。

1.2.3免疫血清效价的检测 于末次免疫后一周进行兔颈动脉无菌取血，4℃冰箱过夜，次日收集血清，分装，置于-80℃冰箱保存。采用补体溶血实验和间接ELISA方法分别检测两种不同免疫方案所制备的免疫血清效价。

1.2.4溶血实验 溶血素稀释度及各种试剂的量，见表2。

1.2.5间接ELISA测定免疫血清效价 用包被缓冲液将抗原(10% SRBC悬液反复冻融5次)1∶100稀释，100 μl/孔加入ELISA板，加封口膜后置4℃过夜。用PBST缓冲液洗板3次后，每孔加入1% BSA封闭液200 μl，37℃孵育。PBST洗涤3次，依次加入倍比稀释的免疫兔血清(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000和1∶512 000)，100 μl/孔，置于 37℃孵育1 h，PBST洗涤5次，甩干后，加入1∶1 000 稀释HRP标记的羊抗兔 IgG 100 μl(同上孵育及洗涤)，加入TMB底物显色液，100 μl/孔，37℃避光反应20 min后，450 nm处读取结果。同时设空白对照和阴性对照孔。

表1 A 组、B 组制备家兔SRBC溶血素的免疫方案

表2 溶血素效价的测定

2 结果

2.1两种免疫方法溶血素效价的比较 A组家兔溶血素效均价为1∶800；B组溶血素效价均为1∶3 200。B组溶血素比A组效价高4倍(见表3)。

2.2两种免疫血清间接ELISA效价的比较 经间接ELISA检测免疫家兔的效价，A组效价均为1∶64 000，B组效价均为1∶256 000。见表4。

表3 两组溶血素效价的测定结果

表4 两组溶血素ELISA的测定结果

3 讨论

补体参与的溶血实验是以绵羊红细胞为抗原，在体外与相应的IgG和/或IgM抗体(溶血素)结合形成抗原抗体复合物，通过经典途径激活补体，在红细胞膜上形成攻膜复合物(MAC)，引起红细胞的溶破，发生溶血反应。由于该实验可验证补体细胞毒的生物学功能，并与临床上常见的输血反应、新生儿溶血症和自身免疫性溶血性贫血密切相关，成为医学免疫学中经典的实验之一。采用SRBC悬液作为抗原，经耳缘静脉免疫家兔制备溶血素是经典的制备溶血素方法[3]。本实验室单抗平台研究组在制备抗肿瘤相关抗原抗体的免疫过程中，设计了完整细胞加佐剂免疫组，其获得阳性克隆的比例明显高于单纯细胞免疫组。受此启发，本研究以常规耳缘静脉免疫途径制备溶血素方法为对照，采用SRBC悬液加佐剂免疫方法制备溶血素，通过比较溶血实验和间接ELISA两种方法，得出结果，加佐剂免疫方法比常规方法制备溶血素效价高4倍，值得推广。溶血素效价的判断可能和实验系统有关。李洱花等[1]和张淑莉等[4]溶血试验中采用0.1 ml 1% SRBC抗原检测溶血素效价达到1∶4 800和1∶3 000。为了方便学生观察实验结果，本溶血实验采用0.2 ml 2% SRBC作为抗原，抗原量比有些院校的溶血实验高4倍，这可能是SRBC悬液经耳缘静脉免疫家兔制备溶血素造成效价差别的原因。