基于中医药快速检测的新型微流控系统研发

廖玲妮

摘  要：20世纪90年代，微流控技术被成功地运用在毛细管技术中，自此开启了其商业化的进程。然而，微流控技术与中医药行业结合并将其运用到中药样本快速检测中尚属首次。该文中介绍的新型微流控系统，基于CMOS-MEMS智能微流控技术，结合高通量芯片点阵技术研制系统，整体架构包括微泵微阀、多靶标检测体系及卡匣及配套光学模组，适用于中药材有效成分、外源性毒性物质的快速与量化分析，可以帮助饮片企业或中药材种植基地等快速评价药材质量。

关键词：智能微流控;中医药快速检测;蛋白芯片;微泵;微阀

中图分类号：R283文献标志码：A

1 中药检测现状与需求分析

中医药是中华民族的瑰宝，几千年来为中华民族的繁衍生息做出了重大贡献。在2000～2020年的20年间，无论从产业规模还是产业水平来说，中医药产业都得到了较大提升。随着《中医药法》《中药药典》等法规的颁布，中药标准化、质量控制体系、有效性和安全性评价等问题引起越来越多的关注。

与西药不同，中药材源于自然，本身具有不稳定性。但中药材作为饮片和中成药的重要原材料，直接关系到临床用药的安全有效及中医药产业的健康发展。近10年来，政府提倡使用中药道地药材，鼓励药材基地化并规定其质量控制应该贯穿药材的炮制、提取到生产的全过程。然而，一方面中药材基地化种植大幅提高了成本，但对于定价却没有相应的优质优价政策，导致基地化种植和非基地化种植的药材价格并没有差异对待，因此很多企业虽然有中药材种植基地认证，实际上还是继续采购基地周边的藥材，这种分散的、自发的种植方式在质量控制上相对薄弱，农药滥用、重金属超标、掺杂掺假、增色增重和保存不善等情况时有发生。另一方面，即使是GPA认证的中药材基地种植的中药材，能否种植出符合“道地药材”要求的中药材，除了种植环境外，还受生产周期、培植情况和气候变化等因素的影响。

目前适应中药材的质量控制手段相对单一，十分依赖仪器设备或者由有经验的老药工进行检验，而现实情况却是传统的中药材性状鉴别人才流失，必要的仪器设备缺乏，检测药材的场所受限严重。因此，建立一种不依赖大型设备与实验室的条件的、灵活便携的、相对快速的检测方式，是中药材质量源头控制急需解决的重要问题。

该文基于中药材质量源头控制的需求，建立一种适应于中药复杂成分的、多靶标的、微量化的、低成本的和相对快速的快检系统，适用于“药物流通前”判断企业内部质量的控制手段，帮助中药材饮片制造及中成药生产厂家降低原材料成本和风险，提高原料质量，保持饮片或中成药质量一致性，最终提高临床用药的安全性和有效性。

2 微流控系统的设计实现

微流控系统具有超微量、高通量和高度集成的特点[1]。该文设计研制的中药样本微流控快速检测系统包括CMOS-MEMS智能微流控微型泵/微阀系统、多靶标快速检测卡匣、定量分析荧光光学模块及数据处理。其中，微泵系统由CMOS-MEMS微泵芯片及其控制器组成。微阀的作用则是通过PDMS软性材料键合到PMMA、PC等塑料卡夹表面，并配合步进电机控制器实现的。多靶标快速检测卡匣由塑料流道、多靶标检测体系组成。荧光光学模块具有绿色/红色2色荧光，同时软件具有点阵分析及数据处理能力。上述模块组合到一起，就形成了中药样本快速检测系统。

系统检测原理如下：将中药样本与抗体混匀，然后一次加入样本/抗体混合液、荧光示踪物、清洗液，通过微泵/微阀控制，使3种液体按一定时序依次通过检测区（如图1所示）。由于检测区域预先包被了待分析物的结构类似物，当样品、特异性抗体流经该区域时会产生竞争性结合，部分抗体与检测区底部结构类似物结合并产生相应信号，且该信号与样品中的待分析物浓度呈负相关性。通过这种竞争性反应可以对样品中待分析物浓度进行量化分析（如图2所示）。

2.1 微泵与微阀元器件

该文中所指微泵是基于正晶圆工艺研制的CMOS-MEMS微泵，其基本原理是基于热发泡技术开发的微型泵，由外部控制器控制其工作电压、发泡频率和泵液方向等参数，使微泵实现在一定时间内的稳定流动，其泵速根据不同流道设计可以达到15 uL/min～30 uL/min，其最大泵液量可以达到400 uL左右，最大泵液时间可以达到0.5 h以上。目前，微泵经软板封装和胶水黏合等工艺方式，固定在快速检测卡匣的底部，为整个反应的进行提供基本动力。

另一方面，基于PDMS等软性材料与常规塑料如PS、PC和PMMA的低温键合技术，首先通过氧等离子体处理活化PDMS/PMMA材料表面，使其产生羟基（-OH），并将PDMS/PMMA同时浸泡在5%ATPES硅烷化试剂中，反应30 min后，经80℃低温加热处理3 h，使PDMS/PMMA表面产生化学交联，达到键合目的。当软性材料贴到流道上方并配合常规步进电机控制时，可以按照一定的时序挤压软性材料，“开启”或“关闭”流道的功能，配合微泵动力源，实现液体流动过程中的自动切换功能。

2.2 多靶标中高通量方案

要实现多靶标测试，首先要对检测项目进行图案化分区设计，包括对反应承载底板进行修饰活化、对检测反应物的精细高通量的固化和对不同检测靶标分区检测。

对于反应体系的底板材质选择，一般以玻璃基为主，配合化学偶联，对目标进行固定化。另外有一些以聚合物为底板（如PMMA等），往往以物理吸附方式进行目标物固化。在测试了石英玻璃、塑料以及硅基后，发现在相同的曝光时间条件下，硅基和石英玻璃能够产生大致相当的信号强度且背景几乎检测不到。在塑料基上则显示出很高的背景信号，其阳性组别与阴性组别的信号值无显著差异。

考虑到硅基脆性以及加工工艺往往是纳米级的，但中药快速检测系统反应体系一般都是微升级的，其流道常常是微米级的，所以选择了在塑料基流道上粘贴硅基检测区作为快速检测方案。

该文设计的硅基尺寸为5.4 mm×5.4 mm，其中设计点阵为12×8个点，点的直径为150 μm，点中心与点中心的间隔为300 μm。对不同靶标固化位置进行了分区。一组核酸质控探针，用于校准不同卡匣或者不同批次存在的表面固化效率差异。一组内参质控，用于校准不同测试间反应效率的差异性。一组梯度浓度的牛血清白蛋白，用于建立片内校准曲线，用于量化分析总黄曲霉素、总人参皂苷、重金属5项共7个标志物。每个点设置4～5个重复点，统计数据时去除一个显著离群值，剩余重复点取平均数（如图1所示）。为了达到设计精度需求，选择了喷墨打印蛋白的方式，单次打印微液滴在氨基化衬底面上形成的直径在20 μm～30 μm，重复打印200次，形成150  μm直径的斑点。

2.3 光学模组

该文中提及的系统结合了微流体控制及阵列式分析，常规的芯片扫描仪由于其仅适配玻璃基芯片，无法兼容为微流控的卡匣设计。同时，由于开放式光学平台如显微镜没有配备相应的软件来进行数据分析，因此在项目研制过程中客制化了一台光学便携式设备（如图2所示），具有类似扫描仪的数据分析能力，可以自动捕获点并批量获得点像素中位数等关键信息。

3 开发技术难点解析

3.1 蛋白表面固化

该文设计的多靶标高通量方案参考了生物芯片的设计思路，与以往的生物芯片不同，该系统选用了硅基替代传统的玻璃基材。首先，在硅基上制作一层氧化层，然后通过等离子体增强化学的气相沉积法（PECVD）技术在表面进行NH2单分子层沉积，通过醛类活化处理，使硅基表面的氨基基团与蛋白表面的氨基基团产生化学交联，达到在硅基表面固化蛋白的效果。

关于表面固化工艺的关键技术，项目开发过程中比较过硅基氧化方式、氧化厚度、氨基修饰方式和醛类活化剂活化条件等。

在硅基氧化工艺中发现，干氧化工艺与湿氧化工艺相比有显著信号显著增高、信号均一性更好的特点，氧化层从100 nm逐步上升到300 nm，其对应的免疫荧光信号值也逐步上升。推测原因，氨基修饰的效果应该与氧基团数量、密度正相关。

使用浸泡法、气相沉积法和等离子体增强化学气相沉积法3种手段，对NH2沉积效果进行比对。通过接触角、免疫信号和均一性判断，发现等离子增强化学气相沉积（PECVD）沉积NH2功能团数量与其他方法几乎一致，但均一性效果更好，片间差异小于5%。

3.2 多标靶同时定量

使用喷墨打印技术对需要固化的区域首先进行活化。对于不同的目标物，在实际测试中发现其固化偶联效率与溶液配方密切相关，不同添加剂对目标物的表面张力、黏度、点样一致性和偶联效率上都会产生影响，最终确认了最适张力、黏度等参数。通过对表面活性剂、pH、增稠剂和保湿剂等多种组分的分析实验，发现加入0.01%Tween20，pH 7.0，5%甘油可以有效改善点样时产生的拖尾、咖啡环和结合效率偏低等问题。

同时，为达到多靶标同时定量的效果，该系统设有2组内参。1）内参质控1是通过合成獲得的DNA—NH2荧光探针，通过DNA—NH2与硅基-NH2交联作用，固化到硅基上，由于DNA—NH2不参与免疫反应，因此内参质控1用于校准不同卡匣在工艺过程中产生的差异。2） 内参质控2偶联了一个标准浓度的惰性蛋白，在反应中加入浓度确定不变的示踪物。由于该内参信号由免疫反应产生，所以可以用于反应过程中的校准，如温度、流速或者样本杂质引起的干扰、不同稀释倍数引起的基质效应等。参考ELISA经典方法，在同一反应片上校准曲线，实现片内定量。通过质控1校准整体荧光信号，质控2校准获得校准曲线及靶标的相对荧光信号，然后通过校准曲线对靶标进行量化分析。与没有进行三重质控的分析方式相比，各靶标的相对偏差RD从57%下降至11%，IC50处的变异系数CV<10%，基本满足样本快速筛选的需求。

4 结语

该项目开发的快速检测系统适用于中药样本快速筛选，判断药材是否符合企业采购标准。在前期研发中基于中药药典的前处理方式，将样本中的待测物如人参皂苷、黄曲霉素、重金属从药材中分离萃取出来，不依赖于HPLC、质谱等大设备，检测时间也缩短至30 min，适合小型监测站乃至田间地头使用。该套快速检测系统同样可以用于其他领域，例如食品安全评价、水质评价和临床POCT检测等领域，属于行业共性技术和平台。

目前该项目集成了7种不同的靶标测试，其技术平台的本质是生物芯片技术，可以集成成百上千的靶标到同一个卡匣中进行测试，实现一次样本处理，从而快速获得全面、高通量的检测结构，特别符合食品安全和中药行业质量控制的需求。

参考文献

[1]陈超瑜，马妍，方群.微流控器官芯片的研究进展[J].分析化学，2019，47（11）：1711-1720.